Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Utilizați o versiune de browser cu suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).În plus, pentru a asigura suport continuu, arătăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Glisoare care arată trei articole pe diapozitiv.Utilizați butoanele înapoi și următorul pentru a vă deplasa prin diapozitive sau butoanele controlerului de diapozitive de la sfârșit pentru a vă deplasa prin fiecare diapozitiv.

317 Furnizori de tuburi spiralate din oțel inoxidabil

Tabel de compoziție chimică a materialului din oțel inoxidabil

PACA6 este o proteină de suprafață exprimată de spermatozoizi, care este critică pentru fuziunea gameților în timpul reproducerii sexuale la mamifere.În ciuda acestui rol fundamental, funcția specifică a PACA6 este puțin înțeleasă.Elucidăm structura cristalină a domeniului extracelular al SPACA6 la o rezoluție de 2,2 Å, dezvăluind o proteină cu două domenii compusă dintr-un pachet cu patru catene și sandvișuri β asemănătoare Ig unite prin linkeri cvasi-flexibili.Această structură seamănă cu IZUMO1, o altă proteină asociată fuziunii gameților, ceea ce face ca SPACA6 și IZUMO1 membri fondatori ai superfamiliei de proteine ​​asociate fertilizării denumite aici superfamilie IST.Superfamilia IST este definită structural de pachetul său răsucit cu patru helix și de o pereche de motive CXXC legate de disulfură.O căutare AlphaFold bazată pe structură a proteomului uman a identificat membri proteici suplimentari ai acestei superfamilii;în special, multe dintre aceste proteine ​​sunt implicate în fuziunea gameților.Structura SPACA6 și relația sa cu alți membri ai superfamiliei IST oferă veriga lipsă în cunoștințele noastre despre fuziunea gameților de mamifere.
Fiecare viață umană începe cu doi gameți haploizi separați: spermatozoizii tatălui și ovulul mamei.Acest spermatozoid este câștigătorul unui proces intens de selecție în timpul căruia milioane de spermatozoizi trec prin tractul genital feminin, depășesc diverse obstacole1 și suferă o capacitate, ceea ce le sporește motilitatea și procesul componentelor de suprafață2,3,4.Chiar dacă spermatozoizii și ovocitul se găsesc unul pe celălalt, procesul nu s-a încheiat încă.Ovocitul este înconjurat de un strat de celule cumulus și de o barieră glicoproteică numită zona pellucida, prin care spermatozoizii trebuie să treacă pentru a pătrunde în ovocit.Spermatozoizii folosesc o combinație de molecule de adeziune la suprafață și enzime asociate și secretate membranei pentru a depăși aceste bariere finale5.Aceste molecule și enzime sunt stocate în principal în membrana interioară și matricea acrozomală și sunt detectate atunci când membrana exterioară a spermatozoizilor este lizată în timpul reacției acrozomale6.Pasul final în această călătorie intensă este evenimentul de fuziune spermatozoid-ovul, în care cele două celule își fuzionează membranele pentru a deveni un singur organism diploid7.Deși acest proces este inovator în reproducerea umană, interacțiunile moleculare necesare sunt puțin înțelese.
Pe lângă fertilizarea gameților, chimia fuziunii a două straturi lipidice a fost studiată pe larg.În general, fuziunea membranei este un proces nefavorabil din punct de vedere energetic, care necesită ca un catalizator proteic să sufere o modificare a conformației structurale care apropie două membrane, întrerupându-le continuitatea și provocând fuziunea8,9.Acești catalizatori proteici sunt cunoscuți ca fusogeni și au fost găsiți în nenumărate sisteme de fuziune.Sunt necesare pentru intrarea virală în celulele gazdă (de exemplu, gp160 în HIV-1, vârf în coronavirus, hemaglutinină în virusurile gripale)10,11,12 fuziuni placentare (sincitina)13,14,15 și formatoare de gameți la eucariotele inferioare ( HAP2/GCS1 în plante, protisti și artropode) 16,17,18,19.Fuzogenii pentru gameții umani nu au fost încă descoperiți, deși mai multe proteine ​​s-au dovedit a fi critice pentru atașarea și fuziunea gameților.CD9 exprimat de ovocite, o proteină transmembranară necesară pentru fuziunea gameților de șoarece și umani, a fost primul descoperit 21,22,23.Deși funcția sa precisă rămâne neclară, un rol în aderență, structura focarelor de adeziune pe microvilozitățile ouălor și/sau localizarea corectă a proteinelor de suprafață a ovocitelor pare probabil 24,25,26.Cele mai tipice două proteine ​​care sunt critice pentru fuziunea gameților sunt proteina spermatozoizilor IZUMO127 și proteina ovocitară JUNO28, iar asocierea lor reciprocă este un pas important în recunoașterea și aderența gameților înainte de fuziune.Șoarecii masculi knockout Izumo1 și femelele Juno knockout sunt complet sterili, la aceste modele spermatozoizii intră în spațiul perivitelin dar gameții nu fuzionează.În mod similar, confluența a fost redusă atunci când gameții au fost tratați cu anticorpi anti-IZUMO1 sau JUNO27,29 în experimentele de fertilizare in vitro la om.
Recent, a fost descoperit un grup nou descoperit de proteine ​​exprimate de spermatozoizi similare fenotipic cu IZUMO1 și JUNO20,30,31,32,33,34,35.Proteina 6 asociată cu membrana acrozomală a spermatozoizilor (SPACA6) a fost identificată ca fiind esențială pentru fertilizare într-un studiu de mutageneză murină la scară largă.Inserția transgenei în gena Spaca6 produce spermatozoizi nefuzibili, deși acești spermatozoizi infiltrează spațiul perivitelin 36 .Studiile knockout ulterioare la șoareci au confirmat că Spaca6 este necesar pentru fuziunea gameților 30,32.SPACA6 se exprimă aproape exclusiv în testicule și are un model de localizare similar cu cel al IZUMO1, și anume în intima spermatozoizilor înainte de reacția acrozomală și apoi migrează în regiunea ecuatorială după reacția acrozomală 30,32.Omologii Spaca6 există la o varietate de mamifere și alte eucariote 30 și importanța sa pentru fuziunea gameților umani a fost demonstrată prin inhibarea fertilizării umane in vitro prin rezistența la SPACA6 30 .Spre deosebire de IZUMO1 și JUNO, detaliile structurii, interacțiunilor și funcției PACA6 rămân neclare.
Pentru a înțelege mai bine procesul fundamental care stă la baza fuziunii spermatozoidului uman și a ovulelor, care ne va permite să informăm evoluțiile viitoare în planificarea familială și tratamentul fertilității, am efectuat studii structurale și biochimice SPANA6.Structura cristalină a domeniului extracelular al SPACA6 prezintă un fascicul cu patru elicoidale (4HB) și un domeniu asemănător imunoglobulinei (Ig-like) conectat prin regiuni cvasi-flexibile.După cum s-a prezis în studiile anterioare, 7,32,37 structura domeniului SPACA6 este similară cu cea a IZUMO1 uman, iar cele două proteine ​​împărtășesc un motiv neobișnuit: 4HB cu o suprafață elicoidală triunghiulară și o pereche de motive CXXC legate de disulfură.Propunem că IZUMO1 și SPACA6 definesc acum o superfamilie mai mare, înrudită structural de proteine ​​asociate cu fuziunea gameților.Folosind caracteristici unice pentru superfamilie, am efectuat o căutare exhaustivă pentru proteomul uman structural AlphaFold, identificând membri suplimentari ai acestei superfamilii, inclusiv câțiva membri implicați în fuziunea gameților și/sau fertilizarea.Acum se pare că există o pliază structurală comună și o superfamilie de proteine ​​asociate cu fuziunea gameților, iar structura noastră oferă o hartă moleculară a acestui aspect important al mecanismului de fuziune a gameților umani.
SPANA6 este o proteină transmembranară cu o singură trecere cu un glican N-legat și șase legături disulfurice presupuse (Figurile S1a și S2).Am exprimat domeniul extracelular al SPACA6 uman (reziduurile 27-246) în celulele Drosophila S2 și am purificat proteina folosind afinitatea nichelului, schimbul de cationi și cromatografia de excludere a mărimii (Fig. S1b).Ectodomeniul SPACA6 purificat este foarte stabil și omogen.Analiza folosind cromatografia de excludere a mărimii combinată cu împrăștierea poligonală a luminii (SEC-MALS) a evidențiat un vârf cu o greutate moleculară calculată de 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Acest lucru este în concordanță cu dimensiunea ectodomeniului monomer SPACA6, indicând faptul că oligomerizarea nu a avut loc în timpul purificării.În plus, spectroscopia circulară de dicroism (CD) a relevat o structură mixtă α/β cu un punct de topire de 51,3 ° C (Fig. S1d, e).Deconvoluția spectrelor CD a evidențiat 38,6% elemente α-helical și 15,8% β-catenare (Figura S1d).
Ectodomeniul SPACA6 a fost cristalizat utilizând însămânțarea aleatorie a matricei38, rezultând un set de date cu o rezoluție de 2,2 Å (Tabelul 1 și Figura S3).Folosind o combinație de substituție moleculară bazată pe fragmente și date de etapă SAD cu expunerea la bromură pentru determinarea structurii (Tabelul 1 și Figura S4), modelul final rafinat constă din reziduurile 27-246.În momentul în care a fost determinată structura, nu existau structuri experimentale sau AlphaFold disponibile.Ectodomeniul SPACA6 măsoară 20 Å × 20 Å × 85 Å, este format din șapte elice și nouă catene β și are un pliu terțiar alungit stabilizat de șase legături disulfurice (Fig. 1a, b).Densitatea slabă de electroni la capătul lanțului lateral Asn243 indică faptul că acest reziduu este o glicozilare N-legată.Structura constă din două domenii: un fascicul N-terminal cu patru helix (4HB) și un domeniu asemănător Ig C-terminal cu o regiune balama intermediară între ele (Fig. 1c).
a Structura domeniului extracelular al PACA6.Diagrama în bandă a domeniului extracelular al PACA6, culoarea lanțului de la N la C-terminal de la albastru închis la roșu închis.Cisteinele implicate în legăturile disulfurice sunt evidențiate în magenta.b Topologia domeniului extracelular al PACA6.Utilizați aceeași schemă de culori ca în Figura 1a.c Domeniul extracelular SPANA6.Diagramele 4HB, balama și benzi de domenii asemănătoare Ig sunt colorate în portocaliu, verde și, respectiv, albastru.Straturile nu sunt desenate la scară.
Domeniul 4HB al SPACA6 include patru elice principale (heliice 1-4), care sunt aranjate sub forma unei elice elicoidale (Fig. 2a), alternând între interacțiuni antiparalele și paralele (Fig. 2b).O mică spirală suplimentară cu o singură tură (helix 1′) este așezată perpendicular pe mănunchi, formând un triunghi cu elice 1 și 2. Acest triunghi este ușor deformat în împachetarea elicoidal răsucită a ambalajului relativ dens a elicelor 3 și 4 ( Fig. 2a).
Diagrama benzilor N-borne 4HB.b Vedere de sus a unui mănunchi de patru elice, fiecare elice evidențiat cu albastru închis la capătul N-terminal și roșu închis la capătul C-terminal.c Diagrama roții spiralate de sus în jos pentru 4HB, fiecare reziduu fiind afișat ca un cerc etichetat cu un cod de aminoacid cu o singură literă;doar cei patru aminoacizi din vârful roții sunt numerotați.Reziduurile nepolare sunt colorate în galben, reziduurile polare neîncărcate sunt colorate în verde, reziduurile încărcate pozitiv sunt colorate în albastru, iar reziduurile încărcate negativ sunt colorate în roșu.d Fețele triunghiulare ale domeniului 4HB, cu 4HBs în portocaliu și balamalele în verde.Ambele inserturi prezintă legături disulfurice în formă de tijă.
4HB este concentrat pe un miez hidrofob interior compus în principal din reziduuri alifatice și aromatice (Fig. 2c).Miezul conține o legătură disulfurică între Cys41 și Cys55 care leagă elicele 1 și 2 împreună într-un triunghi superior ridicat (Fig. 2d).S-au format două legături disulfurice suplimentare între motivul CXXC din Helix 1′ și un alt motiv CXXC găsit la vârful acului de păr β în regiunea balamalei (Fig. 2d).Un reziduu de arginină conservator cu o funcție necunoscută (Arg37) este situat în interiorul unui triunghi gol format din elice 1′, 1 și 2. Atomii de carbon alifatici Cβ, Cγ și Cδ Arg37 interacționează cu miezul hidrofob, iar grupările sale guanidine se mișcă ciclic. între elicele 1′ și 1 prin interacțiuni între coloana vertebrală Thr32 și lanțul lateral (Fig. S5a, b).Tyr34 se extinde în cavitate lăsând două cavități mici prin care Arg37 poate interacționa cu solventul.
Domeniile β-sandwich asemănătoare Ig sunt o superfamilie mare de proteine ​​care împărtășesc caracteristica comună a două sau mai multe foi de β amfipatice multicatenare care interacționează printr-un miez hidrofob 39. Domeniul de tip Ig C-terminal al SPACA6 are același model și este format din două straturi (Fig. S6a).Foaia 1 este o foaie β formată din patru catene (toroane D, F, H și I) în care firele F, H și I formează un aranjament anti-paralel, iar firele I și D au o interacțiune paralelă.Tabelul 2 este o mică foaie beta dublu-catenară anti-paralelă (toroane E și G).S-a observat o legătură disulfurică internă între capătul C-terminal al lanțului E și centrul lanțului H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Această legătură disulfură este analogă cu legătura disulfură din domeniul β-sandwich al imunoglobulinei40,41.
Foaia β cu patru fire se răsucește pe toată lungimea, formând margini asimetrice care diferă ca formă și electrostatică.Marginea mai subțire este o suprafață plată de mediu hidrofobă care iese în evidență în comparație cu suprafețele neuniforme rămase și diverse electrostatic din PACA6 (Fig. S6b, c).Un halou de grupări carbonil/amino expuse și lanțuri laterale polare înconjoară suprafața hidrofobă (Fig. S6c).Marginea mai largă este acoperită de un segment elicoidal acoperit care blochează porțiunea N-terminală a miezului hidrofob și formează trei legături de hidrogen cu grupul polar deschis al coloanei vertebrale a lanțului F (Fig. S6d).Porțiunea C-terminală a acestei margini formează un buzunar mare cu un miez hidrofob parțial expus.Buzunarul este înconjurat de sarcini pozitive datorită a trei seturi de resturi duble de arginină (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 și Arg212-Arg214) și o histidină centrală (His220) (Figura S6e).
Regiunea balama este un segment scurt între domeniul elicoidal și domeniul asemănător Ig, constând dintr-un strat β cu trei catene antiparalel (catenele A, B și C), un helix mic de 310 și mai multe segmente elicoidale aleatoare lungi.(Fig. S7).O rețea de contacte covalente și electrostatice în regiunea balamalei pare să stabilizeze orientarea dintre 4HB și domeniul Ig-like.Rețeaua poate fi împărțită în trei părți.Prima parte include două motive CXXC (27CXXC30 și 139CXXC142) care formează o pereche de legături disulfurice între ac de păr β din balama și helixul 1′ din 4HB.A doua parte include interacțiuni electrostatice între domeniul Ig-like și balama.Glu132 în balama formează o punte de sare cu Arg233 în domeniul Ig-like și Arg135 în balama.A treia parte include o legătură covalentă între domeniul Ig-like și regiunea balama.Două legături disulfurice (Cys124-Cys147 și Cys128-Cys153) conectează bucla balama la un linker care este stabilizat prin interacțiuni electrostatice între Gln131 și grupul funcțional principal, permițând accesul la primul domeniu asemănător Ig.lanţ.
Structura ectodomeniului SPANA6 și structurile individuale ale domeniilor 4HB și Ig-like au fost utilizate pentru a căuta înregistrări similare structural în bazele de date de proteine ​​42 .Am identificat potriviri cu scoruri Dali Z ridicate, abateri standard mici și scoruri LALI mari (cel din urmă fiind numărul de reziduuri echivalente structural).În timp ce primele 10 accesări din căutarea ectodomeniului complet (Tabelul S1) au avut un scor Z acceptabil de> 842, o căutare numai pentru domeniul 4HB sau Ig-like a arătat că cele mai multe dintre aceste hit-uri corespund doar β-sandvișurilor.un pliu omniprezent găsit în multe proteine.Toate cele trei căutări din Dali au returnat un singur rezultat: IZUMO1.
S-a sugerat de mult timp că SPANA6 și IZUMO1 au similarități structurale7,32,37.Deși ectodomeniile acestor două proteine ​​asociate fuziunii gameților împărtășesc doar 21% identitate de secvență (Figura S8a), dovezi complexe, inclusiv un model de legătură disulfură conservat și un domeniu de tip Ig C-terminal prezis în SPACA6, au permis încercările timpurii de a construi un model de omologie al lui A un șoarece PACA6 folosind IZUMO1 ca șablon37.Structura noastră confirmă aceste predicții și arată adevăratul grad de similitudine.De fapt, structurile SPACA6 și IZUMO137,43,44 au aceeași arhitectură cu două domenii (Fig. S8b) cu domenii similare 4HB și β-sandwich asemănătoare Ig conectate printr-o regiune balama (Fig. S8c).
IZUMO1 și PACA6 4HB au diferențe comune față de fasciculele spiralate convenționale.4HB-urile tipice, precum cele găsite în complexele proteice SNARE implicate în fuziunea endozomală 45,46, au elice uniform distanțate menținând o curbură constantă în jurul unei axe centrale 47. În schimb, domeniile elicoidale atât în ​​IZUMO1, cât și în SPACA6 au fost distorsionate, cu curbură variabilă și ambalare neuniformă (Figura S8d).Răsucirea, probabil cauzată de triunghiul format din elice 1′, 1 și 2, este reținută în IZUMO1 și SPACA6 și stabilizată de același motiv CXXC pe elica 1′.Cu toate acestea, legătura disulfurică suplimentară găsită în SPACA6 (Cys41 și Cys55 care leagă covalent elice 1 și 2 de mai sus) creează un vârf mai ascuțit la vârful triunghiului, făcând SPACA6 mai răsucit decât IZUMO1, cu triunghiuri cavitate mai pronunțate.În plus, IZUMO1 nu are Arg37 observat în centrul acestei cavități în PACA6.În schimb, IZUMO1 are un miez hidrofob mai tipic de reziduuri alifatice și aromatice.
IZUMO1 are un domeniu asemănător Ig constând dintr-o foaie β dublu catenară și cinci catenare43.Șuvița suplimentară din IZUMO1 înlocuiește bobina din SPACA6, care interacționează cu catena F pentru a limita legăturile de hidrogen ale coloanei vertebrale din catena.Un punct de comparație interesant este sarcina de suprafață prezisă a domeniilor Ig-like ale celor două proteine.Suprafața IZUMO1 este mai încărcată negativ decât suprafața PACA6.O taxă suplimentară este situată în apropierea capătului C-terminal cu fața spre membrana spermatozoizilor.În PACA6, aceleași regiuni au fost mai neutre sau încărcate pozitiv (Fig. S8e).De exemplu, suprafața hidrofobă (marginile mai subțiri) și gropile încărcate pozitiv (marginile mai largi) din SPACA6 sunt încărcate negativ în IZUMO1.
Deși relația și elementele de structură secundară dintre IZUMO1 și SPACA6 sunt bine conservate, alinierea structurală a domeniilor Ig-like a arătat că cele două domenii diferă în orientarea lor generală unul față de celălalt (Fig. S9).Mănunchiul spiralat al lui IZUMO1 este curbat în jurul β-sandwich-ului, creând forma de „bumerang” descrisă anterior la aproximativ 50 ° față de axa centrală.În schimb, fasciculul elicoidal din PACA6 a fost înclinat cu aproximativ 10° în direcția opusă.Diferențele dintre aceste orientări se datorează probabil diferențelor în regiunea balamalei.La nivel de secvență primară, IZUMO1 și SPACA6 au o mică asemănare de secvență la balama, cu excepția reziduurilor de cisteină, glicină și acid aspartic.Ca rezultat, legăturile de hidrogen și rețelele electrostatice sunt complet diferite.Elementele structurii secundare ale foii β sunt împărtășite de IZUMO1 și SPACA6, deși lanțurile din IZUMO1 sunt mult mai lungi, iar helixul 310 (helixul 5) este unic pentru SPACA6.Aceste diferențe au ca rezultat orientări diferite de domeniu pentru două proteine ​​altfel similare.
Căutarea noastră pe serverul Dali a dezvăluit că SPACA6 și IZUMO1 sunt singurele două structuri determinate experimental stocate în baza de date de proteine ​​care au această îndoială de 4HB (Tabelul S1).Mai recent, DeepMind (Alphabet/Google) a dezvoltat AlphaFold, un sistem bazat pe rețele neuronale care poate prezice cu precizie structurile 3D ale proteinelor din secvențele primare48.La scurt timp după ce am rezolvat structura SPACA6, a fost lansată baza de date AlphaFold, oferind modele de structură predictivă care acoperă 98,5% din toate proteinele din proteomul uman48,49.Folosind structura noastră SPACA6 rezolvată ca model de căutare, o căutare de omologie structurală pentru modelul din proteomul uman AlphaFold a identificat candidați cu posibile asemănări structurale cu SPACA6 și IZUMO1.Având în vedere acuratețea incredibilă a AlphaFold în prezicerea SPACA6 (Fig. S10a) - în special ectodomeniul de 1,1 Å rms în comparație cu structura noastră rezolvată (Fig. S10b) - putem fi încrezători că potrivirile SPACA6 identificate sunt probabil să fie exacte.
Anterior, PSI-BLAST a căutat grupul IZUMO1 cu alte trei proteine ​​asociate spermatozoizilor: IZUMO2, IZUMO3 și IZUMO450.AlphaFold a prezis că aceste proteine ​​​​familiei IZUMO se pliază în domeniul 4HB cu același model de legătură disulfură ca IZUMO1 (Figurile 3a și S11), deși le lipsește un domeniu asemănător Ig.Se presupune că IZUMO2 și IZUMO3 sunt proteine ​​​​membranoase unilaterale similare cu IZUMO1, în timp ce IZUMO4 pare a fi secretat.Funcțiile proteinelor IZUMO 2, 3 și 4 în fuziunea gameților nu au fost determinate.Se știe că IZUMO3 joacă un rol în biogeneza acrozomului în timpul dezvoltării spermatozoizilor51, iar proteina IZUMO formează un complex50.Conservarea proteinelor IZUMO la mamifere, reptile și amfibieni sugerează că funcția lor potențială este în concordanță cu cea a altor proteine ​​cunoscute asociate fuziunii gameților, cum ar fi DCST1/2, SOF1 și FIMP.
Diagrama arhitecturii domeniului superfamiliei IST, cu 4HB, balama și domenii asemănătoare Ig evidențiate în portocaliu, verde și, respectiv, albastru.IZUMO4 are o regiune unică C-terminală care arată negru.Legăturile disulfurice confirmate și presupuse sunt indicate prin linii solide și, respectiv, punctate.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) și (AlphaTMEM95) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) sunt afișate în aceeași gamă de culori ca panoul A. Legăturile disulfură sunt afișate cu magenta.Elice transmembranare TMEM95, IZUMO2 și IZUMO3 nu sunt prezentate.
Spre deosebire de proteina IZUMO, alte proteine ​​SPACA (de exemplu, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 și SPACA9) sunt considerate a fi diferite structural de SPACA6 (Fig. S12).Doar SPACA9 are 4HB, dar nu este de așteptat să aibă aceeași orientare paralel-anti-paralelă sau aceeași legătură disulfurică ca SPACA6.Doar SPACA1 are un domeniu similar Ig-like.AlphaFold prezice că SPACA3, SPACA4 și SPACA5 au o structură complet diferită de SPACA6.Interesant este că SPACA4 este, de asemenea, cunoscut că joacă un rol în fertilizare, dar într-o măsură mai mare decât SPACA6, facilitând în schimb interacțiunea dintre spermatozoizi și zona pellucida a ovocitelor52.
Căutarea noastră AlphaFold a găsit o altă potrivire pentru IZUMO1 și PACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, o singură proteină transmembranară specifică spermatozoizilor, face șoarecii masculi infertili atunci când sunt ablați 32,33.Spermatozoizii lipsiți de TMEM95 aveau morfologie, motilitate și capacitatea de a pătrunde în zona pellucida și de a se lega de membrana oului, dar nu au putut fuziona cu membrana ovocitului.Studiile anterioare au arătat că TMEM95 are asemănări structurale cu IZUMO133.Într-adevăr, modelul AlphaFold a confirmat că TMEM95 este un 4HB cu aceeași pereche de motive CXXC ca IZUMO1 și SPACA6 și aceeași legătură disulfurică suplimentară între elicele 1 și 2 găsită în SPACA6 (Fig. 3a și S11).Deși TMEM95 nu are un domeniu asemănător Ig, are o regiune cu un model de legătură disulfură similar cu regiunile balama SPACA6 și IZUMO1 (Fig. 3b).La momentul publicării acestui manuscris, serverul de preprint a raportat structura TMEM95, confirmând rezultatul AlphaFold53.TMEM95 este foarte asemănător cu SPACA6 și IZUMO1 și este conservat evolutiv deja la amfibieni (Fig. 4 și S13).
Căutarea PSI-BLAST a folosit bazele de date NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP și SOF1 pentru a determina poziția acestor secvențe în arborele vieții.Distanțele dintre punctele de ramificație nu sunt afișate la scară.
Asemănarea structurală generală izbitoare dintre SPACA6 și IZUMO1 sugerează că aceștia sunt membri fondatori ai unei superfamilii structurale conservate care include proteinele TMEM95 și IZUMO 2, 3 și 4.membri cunoscuți: IZUMO1, SPACA6 și TMEM95.Deoarece doar câțiva membri posedă domenii asemănătoare Ig, semnul distinctiv al superfamiliei IST este domeniul 4HB, care are caracteristici unice comune tuturor acestor proteine: 1) 4HB încolăcit cu elice dispuse într-o alternanță anti-paralel/paralel (Fig. . 5a), 2) fasciculul are o față triunghiulară constând din două elice în cadrul mănunchiului și o a treia spirală verticală (fig. zona cheie (Fig. 5c). Motivul CXXC, găsit în proteinele asemănătoare tioredoxinei, este cunoscut că funcționează ca senzor redox 54,55,56, în timp ce motivul din membrii familiei IST poate fi asociat cu proteine ​​disulfură izomeraze precum ERp57 în fuziunea gameților.Rolurile sunt asociate 57,58.
Membrii superfamiliei IST sunt definiți de trei trăsături caracteristice ale domeniului 4HB: patru elice care alternează între orientarea paralelă și antiparalelă, fețele fasciculului elicoidal ba-triunghiular și un motiv dublu ca CXXC format între molecule mici.) Helixele N-terminale (portocaliu) și regiunea balamalei β-ac de păr (verde).
Având în vedere asemănarea dintre SPACA6 și IZUMO1, a fost testată capacitatea primului de a se lega de IZUMO1 sau JUNO.Interferometria biostrat (BLI) este o metodă de legare bazată pe cinetică care a fost utilizată anterior pentru a cuantifica interacțiunea dintre IZUMO1 și JUNO.După incubarea senzorului marcat cu biotină cu IZUMO1 ca momeală cu o concentrație mare de analit JUNO, a fost detectat un semnal puternic (Fig. S14a), indicând o modificare indusă de legare a grosimii biomaterialului atașat la vârful senzorului.Semnale similare (adică, JUNO cuplat la senzor ca momeală împotriva analitului IZUMO1) (Fig. S14b).Nu a fost detectat niciun semnal atunci când SPACA6 a fost utilizat ca analit împotriva IZUMO1 legat de senzor sau JUNO legat de senzor (Figura S14a, b).Absența acestui semnal indică faptul că domeniul extracelular al SPACA6 nu interacționează cu domeniul extracelular al IZUMO1 sau JUNO.
Deoarece testul BLI se bazează pe biotinilarea reziduurilor libere de lizină de pe proteina momeală, această modificare poate preveni legarea dacă reziduurile de lizină sunt implicate în interacțiune.În plus, orientarea legării în raport cu senzorul poate crea obstacole sterice, astfel încât testele convenționale pull-down au fost efectuate și pe ectodomeniile recombinate SPACA6, IZUMO1 și JUNO.În ciuda acestui fapt, SPACA6 nu a precipitat cu IZUMO1 etichetat cu His sau JUNO marcat cu His (Fig. S14c, d), indicând nicio interacțiune compatibilă cu cea observată în experimentele BLI.Ca control pozitiv, am confirmat interacțiunea lui JUNO cu His IZUMO1 etichetat (Figurile S14e și S15).
În ciuda similitudinii structurale dintre SPACA6 și IZUMO1, incapacitatea SPACA6 de a lega JUNO nu este surprinzătoare.Suprafața IZUMO1 umană are mai mult de 20 de reziduuri care interacționează cu JUNO, inclusiv reziduuri din fiecare dintre cele trei regiuni (deși majoritatea dintre ele sunt situate în regiunea balamalei) (Fig. S14f).Dintre aceste reziduuri, doar unul este conservat în SPACA6 (Glu70).În timp ce multe substituții de reziduuri și-au păstrat proprietățile biochimice originale, reziduul esențial Arg160 din IZUMO1 a fost înlocuit cu Asp148 încărcat negativ în SPACA6;studiile anterioare au arătat că mutația Arg160Glu din IZUMO1 elimină aproape complet legarea de JUNO43.În plus, diferența de orientare a domeniului dintre IZUMO1 și SPACA6 a crescut semnificativ suprafața site-ului de legare JUNO a regiunii echivalente de pe SPACA6 (Fig. S14g).
În ciuda necesității cunoscute de SPACA6 pentru fuziunea gameților și a asemănării sale cu IZUMO1, SPACA6 nu pare să aibă o funcție echivalentă de legare a JUNO.Prin urmare, am căutat să combinăm datele noastre structurale cu dovezi de importanță oferite de biologia evolutivă.Alinierea secvenței omologilor SPANA6 arată conservarea structurii comune dincolo de mamifere.De exemplu, reziduurile de cisteină sunt prezente chiar și la amfibienii înrudiți la distanță (Fig. 6a).Folosind serverul ConSurf, datele de reținere a alinierii secvențelor multiple din 66 de secvențe au fost mapate pe suprafața SPACA6.Acest tip de analiză poate arăta ce reziduuri au fost conservate în timpul evoluției proteinelor și poate indica care regiuni de suprafață joacă un rol în funcție.
a Alinierea secvenței ectodomeniilor SPANA6 din 12 specii diferite preparate folosind CLUSTAL OMEGA.Conform analizei ConSurf, cele mai conservatoare poziții sunt marcate cu albastru.Reziduurile de cisteină sunt evidențiate cu roșu.Granițele domeniului și elementele de structură secundară sunt afișate în partea de sus a aliniamentului, unde săgețile indică firele β, iar undele indică elice.Identificatorii de acces NCBI care conțin secvențele sunt: ​​om (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), maimuță capucină (Cebus mimic, XP_017359366), cal (Equus caballus), (Equus caballus, XP_02350235) XP_032_034) .), oaie (Ovis aries, XP_014955560), elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), câine (Canis lupus familyis, XP_025277208), șoarece (Mus musculus, NP_001156381), diavolul tasmanian (Sarpi1, XP_03), XP_03 8) , 61_89 și Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Numerotarea se bazează pe ordinea umană.b Reprezentarea suprafeței structurii SPACA6 cu 4HB în partea de sus și domeniul Ig-like în partea de jos, culori bazate pe estimările de conservare de la serverul ConSurf.Cele mai bine conservate părți sunt în albastru, părțile moderat conservate sunt în alb, iar cele mai puțin conservate sunt în galben.cisteină violetă.Trei petice de suprafață care demonstrează un nivel înalt de protecție sunt afișate în insertul etichetat patch-urile 1, 2 și 3. Un desen animat 4HB este afișat în interiorul din dreapta sus (aceeași schemă de culori).
Structura PACA6 are trei regiuni de suprafață foarte conservate (Fig. 6b).Patch-ul 1 se întinde pe 4HB și regiunea balama și conține două punți de disulfură CXXC conservate, o rețea de balama Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) și trei reziduuri aromatice exterioare conservate (Phe31, Tyr73, Phe137).o margine mai largă a domeniului Ig-like (Fig. S6e), care reprezintă câteva reziduuri încărcate pozitiv pe suprafața spermatozoizilor.Interesant este că acest plasture conține un epitop de anticorpi care s-a dovedit anterior că interferează cu funcția SPACA6 30.Regiunea 3 se întinde pe balama și pe o parte a domeniului de tip Ig;această regiune conține proline conservate (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) și reziduuri polare/încărcate orientate spre exterior.În mod surprinzător, majoritatea reziduurilor de pe suprafața lui 4HB sunt foarte variabile (Fig. 6b), deși pliul este conservat în întregul omolog SPACA6 (după cum este indicat de conservatorismul miezului fasciculului hidrofob) și dincolo de superfamilie IST.
Deși aceasta este cea mai mică regiune din SPACA6 cu cele mai puține elemente de structură secundară detectabile, multe rămășițe de regiune balama (inclusiv regiunea 3) sunt foarte conservate printre omologii SPACA6, ceea ce poate indica că orientarea fasciculului elicoidal și β-sandwich-ul joacă un rol.ca un conservator.Cu toate acestea, în ciuda legăturilor de hidrogen extinse și a rețelelor electrostatice din regiunea balamalei a lui SPACA6 și IZUMO1, dovezi de flexibilitate intrinsecă pot fi observate în alinierea multiplelor structuri permise ale IZUMO137,43,44.Alinierea domeniilor individuale s-a suprapus bine, dar orientarea domeniilor unul față de celălalt a variat de la 50° la 70° față de axa centrală (Fig. S16).Pentru a înțelege dinamica conformațională a PACA6 în soluție, au fost efectuate experimente SAXS (Fig. S17a, b).Reconstrucția ab initio a ectodomeniului SPACA6 s-a conformat unei structuri cristaline cu tije (Fig. S18), deși diagrama Kratky a arătat un anumit grad de flexibilitate (Fig. S17b).Această conformație contrastează cu IZUMO1, în care proteina nelegată ia o formă de bumerang atât în ​​rețea, cât și în soluție43.
Pentru a identifica în mod specific regiunea flexibilă, a fost efectuată spectroscopie de masă cu schimb hidrogen-deuteriu (H-DXMS) pe SPACA6 și a fost comparată cu datele obținute anterior pe IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 este în mod clar mai flexibil decât IZUMO1, așa cum indică un schimb mai mare de deuteriu în întreaga structură după 100.000 de secunde de schimb.În ambele structuri, partea C-terminală a regiunii balama arată un nivel ridicat de schimb, care permite probabil o rotație limitată a domeniilor 4HB și Ig-like unul față de celălalt.Interesant, partea C-terminală a balamalei SPACA6, constând din reziduul 147CDLPLDCP154, este o regiune 3 foarte conservată (Fig. 6b), indicând posibil că flexibilitatea interdomeniului este o caracteristică conservată evolutiv a SPACA6.Conform analizei de flexibilitate, datele de topire termică CD au arătat că SPACA6 (Tm = 51,2 °C) este mai puțin stabil decât IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Fig. S1e și S19).
a imagini H-DXMS ale PACA6 și b IZUMO1.Schimbul procentual de deuteriu a fost determinat la momentele de timp indicate.Nivelurile schimbului hidrogen-deuteriu sunt indicate prin culoare pe o scară de gradient de la albastru (10%) la roșu (90%).Cutiile negre reprezintă zone de schimb ridicat.Limitele 4HB, balama și domeniul asemănător Ig observate în structura cristalină sunt prezentate deasupra secvenței primare.Nivelurile de schimb de deuteriu la 10 s, 1000 s și 100.000 s au fost reprezentate pe o diagramă în bandă suprapusă pe suprafețele moleculare transparente ale SPACA6 și IZUMO1.Părțile structurilor cu un nivel de schimb de deuteriu sub 50% sunt colorate în alb.Zonele de peste 50% schimb H-DXMS sunt colorate într-o scară de gradient.
Utilizarea strategiilor genetice CRISPR/Cas9 și a genei de șoarece a dus la identificarea mai multor factori importanți pentru legarea și fuziunea spermatozoizilor și ovulelor.În afară de interacțiunea bine caracterizată a structurii IZUMO1-JUNO și CD9, majoritatea proteinelor asociate cu fuziunea gameților rămân enigmatice structural și funcțional.Caracterizarea biofizică și structurală a PACA6 este o altă piesă a puzzle-ului molecular de aderență/fuziune în timpul fertilizării.
SPACA6 și alți membri ai superfamiliei IST par a fi foarte conservați la mamifere, precum și la păsări individuale, reptile și amfibieni;de fapt, se crede că SPACA6 este chiar necesar pentru fertilizare la peștele zebra 59. Această distribuție este similară cu alte proteine ​​cunoscute asociate fuziunii gameților, cum ar fi DCST134, DCST234, FIMP31 și SOF132, sugerând că acești factori sunt deficienți de HAP2 (de asemenea cunoscut sub numele de GCS1) proteine ​​care sunt responsabile pentru activitatea catalitică a multor protisti., plante și artropode.Proteine ​​de fuziune fertilizate 60, 61. În ciuda similitudinii structurale puternice dintre PACA6 și IZUMO1, eliminarea genelor care codifică oricare dintre aceste proteine ​​a dus la infertilitate la șoarecii masculi, indicând faptul că funcțiile lor în fuziunea gameților nu sunt duplicate..Mai larg, niciuna dintre proteinele spermatozoizilor cunoscute necesare pentru faza de adeziune a fuziunii nu este redundantă.
Rămâne o întrebare deschisă dacă SPACA6 (și alți membri ai superfamiliei IST) participă la joncțiuni intergametice, formează rețele intragametice pentru a recruta proteine ​​importante în punctele de fuziune sau poate chiar acționează ca fusogeni evazivi.Studiile de co-imunoprecipitare în celulele HEK293T au evidențiat o interacțiune între IZUMO1 de lungime completă și PACA632.Cu toate acestea, ectodomeniile noastre recombinate nu au interacționat in vitro, ceea ce sugerează că interacțiunile observate în Noda și colab.ambele au fost șterse în construcție (observați coada citoplasmatică a IZUMO1, care s-a dovedit a fi inutilă pentru fertilizare62).Alternativ, IZUMO1 și/sau PACA6 pot necesita medii de legare specifice pe care nu le reproducem in vitro, cum ar fi conformații specifice fiziologic sau complexe moleculare care conțin alte proteine ​​(cunoscute sau nedescoperite încă).Deși se crede că ectodomeniul IZUMO1 mediază atașarea spermatozoizilor la ovul în spațiul perivitelin, scopul ectodomeniului SPANA6 este neclar.
Structura SPANA6 dezvăluie mai multe suprafețe conservate care pot fi implicate în interacțiunile proteină-proteină.Partea conservată a regiunii balama imediat adiacentă motivului CXXC (denumită Patch 1 mai sus) are mai multe reziduuri aromatice orientate spre exterior, care sunt adesea asociate cu interacțiuni hidrofobe și π-stivuire între biomolecule.Părțile largi ale domeniului Ig-like (regiunea 2) formează un canal încărcat pozitiv cu resturi Arg și His foarte conservate, iar anticorpii împotriva acestei regiuni au fost utilizați anterior pentru a bloca fuziunea gameților 30 .Anticorpul recunoaște epitopul liniar 212RIRPAQLTHRGTFS225, care are trei dintre cele șase resturi de arginină și His220 foarte conservat.Nu este clar dacă disfuncția se datorează blocării acestor reziduuri specifice sau a întregii regiuni.Locația acestui gol în apropierea capătului C-terminal al β-sandwich-ului indică interacțiuni cis cu proteinele spermatozoizilor vecine, dar nu și cu proteinele ovocitelor.Mai mult, reținerea unei încurcături foarte flexibile bogate în prolină (locul 3) în balama poate fi locul unei interacțiuni proteină-proteină sau, mai probabil, poate indica păstrarea flexibilității între cele două domenii.Genul este important pentru rolul necunoscut al PACA6.fuziunea gameților.
PACA6 are proprietăți ale proteinelor de adeziune intercelulară, inclusiv sandvișurile β asemănătoare Ig.Multe proteine ​​adezive (de exemplu, cadherine, integrine, adezine și IZUMO1) posedă unul sau mai multe domenii β-sandwich care extind proteinele de la membrana celulară la țintele lor de mediu63,64,65.Domeniul Ig-like al SPACA6 conține, de asemenea, un motiv întâlnit în mod obișnuit în β-sandwich-urile de aderență și coeziune: dublete de fire paralele la capetele β-sandwich-urilor, cunoscute sub numele de cleme mecanice66.Se crede că acest motiv crește rezistența la forțele de forfecare, ceea ce este valoros pentru proteinele implicate în interacțiunile intercelulare.Cu toate acestea, în ciuda acestei asemănări cu adezinele, în prezent nu există dovezi că SPACA6 interacționează cu albușurile de ou.Ectodomeniul SPACA6 nu se poate lega de JUNO, iar celulele HEK293T care exprimă SPACA6, așa cum se arată aici, interacționează cu greu cu ovocitele lipsite de zona 32.Dacă PACA6 stabilește legături intergametice, aceste interacțiuni pot necesita modificări post-translaționale sau stabilizare de către alte proteine ​​​​din spermatozoizi.În sprijinul acestei din urmă ipoteze, spermatozoizii cu deficit de IZUMO1 se leagă de ovocite, demonstrând că alte molecule decât IZUMO1 sunt implicate în etapa de aderență a gameților 27 .
Multe proteine ​​de fuziune virale, celulare și de dezvoltare au proprietăți care prezic funcția lor ca fusogeni.De exemplu, glicoproteinele de fuziune virale (clasele I, II și III) au o peptidă sau o buclă de fuziune hidrofobă la capătul proteinei care este inserată în membrana gazdă.Harta hidrofilității IZUMO143 și structura (determinată și prezisă) superfamiliei IST nu au arătat nicio peptidă de fuziune hidrofobă aparentă.Astfel, dacă orice proteine ​​din superfamilia IST funcționează ca fusogeni, ele fac acest lucru într-un mod diferit de alte exemple cunoscute.
În concluzie, funcțiile membrilor superfamiliei IST de proteine ​​asociate cu fuziunea gameților rămân un mister tentant.Molecula noastră recombinată PACA6 caracterizată și structura sa rezolvată vor oferi o perspectivă asupra relațiilor dintre aceste structuri comune și rolul lor în atașarea și fuziunea gameților.
Secvența ADN corespunzătoare ectodomeniului uman SPACA6 prezis (numărul de acces NCBI NP_001303901.1; reziduurile 27–246) a fost optimizată cu codon pentru exprimarea în celulele Drosophila melanogaster S2 și sintetizată ca un fragment de genă cu secvența care codifică Kozak (Eurofin)., semnalul de secreție BiP și capetele 5′ și 3′ corespunzătoare pentru donarea independentă de ligatură a acestei gene într-un vector de expresie pMT bazat pe un promotor de metalotioneină modificat pentru selecție cu puromicina (pMT-puro).Vectorul pMT-puro codifică un situs de clivaj a trombinei urmat de o etichetă C-terminală 10x-His (Figura S2).
Transfecția stabilă a vectorului PACA6 pMT-puro în celulele D. melanogaster S2 (Gibco) a fost efectuată în mod similar cu protocolul utilizat pentru IZUMO1 și JUNO43.Celulele S2 au fost dezghețate și crescute în mediu Schneider (Gibco) suplimentat cu o concentrație finală de 10% (v/v) ser fetal de vițel inactivat termic (Gibco) și antibiotic antimicotic 1X (Gibco).Celulele de trecere timpurie (3,0 x 106 celule) au fost placate în godeuri individuale de plăci cu 6 godeuri (Corning).După 24 de ore de incubare la 27°C, celulele au fost transfectate cu un amestec de 2 mg de vector PACA6 pMT-puro și reactiv de transfecție Effectene (Qiagen) conform protocolului producătorului.Celulele transfectate au fost incubate timp de 72 de ore și apoi recoltate cu 6 mg/ml puromicină.Celulele au fost apoi izolate din mediul Schneider complet și plasate în mediu Insect-XPRESS fără ser (Lonza) pentru producția de proteine ​​la scară largă.Un lot de 1 L de cultură de celule S2 a fost crescut la 8-10 × 106 ml-1 celule într-un balon Erlenmeyer din polipropilenă cu fund plat ventilat de 2 L și apoi sterilizat cu o concentrație finală de 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) și filtrat steril.induse.Culturile induse au fost incubate la 27°C la 120 rpm timp de patru zile.
Mediul condiționat care conține SPACA6 a fost izolat prin centrifugare la 5660 x g la 4°C urmată de un sistem de filtrare cu flux tangențial Centramate (Pall Corp) cu o membrană MWCO de 10 kDa.Se aplică mediu concentrat care conține SPACA6 pe o coloană de 2 ml de rășină de agaroză Ni-NTA (Qiagen).Rășina Ni-NTA a fost spălată cu 10 volume de coloană (CV) de tampon A și apoi a fost adăugat 1 CV de tampon A pentru a da o concentrație finală de imidazol de 50 mM.SPACA6 a fost eluat cu 10 ml de tampon A suplimentat cu imidazol la o concentraţie finală de 500 mM.Trombina din clasa de restricție (Millipore Sigma) a fost adăugată direct la tubul de dializă (MWCO 12-14 kDa) la 1 unitate per mg SPACA6 față de 1 L 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 și 150 mM NaCI (tampon B) pentru dializă.) la 4°C timp de 48 de ore.SPACA6 scindat cu trombină a fost apoi diluat de trei ori pentru a reduce concentrația de sare și încărcat pe o coloană schimbătoare de cationi MonoS 5/50 GL de 1 ml (Cytiva/GE) echilibrată cu 10 mM Tris-HCI, pH 7,5.Schimbătorul de cationi a fost spălat cu 3 OK 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, apoi SPACA6 a fost eluat cu un gradient liniar de la 0 la 500 mm NaCI în 10 mm Tris-HCI, pH 7,5 pentru 25 OK.După cromatografie cu schimb de ioni, SPACA6 a fost concentrat la 1 ml şi eluat izocratic dintr-o coloană ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) echilibrată cu tampon B. Conform cromatogramei, fracţiile de amestec şi concentrat conţinând SPACA6.Puritatea a fost controlată prin electroforeză colorată cu Coomassie pe un gel SDS-poliacrilamidă 16%.Concentrația de proteine ​​a fost cuantificată prin absorbanță la 280 nm folosind legea Beer-Lambert și coeficientul de extincție molar teoretic.
SPACA6 purificat a fost dializat peste noapte cu fosfat de sodiu 10 mM, pH 7,4 și 150 mM NaF și diluat la 0,16 mg/mL înainte de analiza prin spectroscopie CD.Scanarea spectrală a CD-urilor cu o lungime de undă de 185 până la 260 nm a fost colectată pe un spectropolarimetru Jasco J-1500 folosind cuve de cuarț cu o lungime a căii optice de 1 mm (Helma) la 25°C la o viteză de 50 nm/min.Spectrele CD au fost corectate la linia de bază, au fost mediate peste 10 achiziții și au fost convertite la elipticitatea reziduală medie (θMRE) în grade cm2/dmol:
unde MW este greutatea moleculară a fiecărei probe în Da;N este numărul de aminoacizi;θ este elipticitatea în miligrade;d corespunde lungimii căii optice în cm;concentrația proteinelor în unități.