ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tub duplex sudat pentru componenta chimică a industriei chimice, Deficiența SPECC1L duce la o stabilitate crescută a articulațiilor îmbinate și la o pierdere redusă a celulelor crestei neurale craniene.

Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Utilizați o versiune de browser cu suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).În plus, pentru a asigura suport continuu, arătăm site-ul fără stiluri și JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tub duplex sudat pentru industria chimică

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.este un producător de frunte care este specializat în țevi fără sudură din oțel inoxidabil, tuburi strălucitoare recoapte, tuburi spiralate fără sudură etc.Pentru a facilita clienții, avem și țevi și țevi sudate.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.are cele mai avansate echipamente de producție și testare.Vă putem satisface în totalitate cerința.Conform standardului foarte strict, tuburile produse de noi au întotdeauna toleranța corectă de OD și WT.Controlul toleranței este strict în conformitate pentru a produce standarde.Produsele noastre sunt întotdeauna mulțumite de clienți.Clienții care au cumpărat produsele noastre au creat mai multe profituri.
a) OD (diametru exterior): 3,18 mm până la 101,6 mm
b) WT (grosime perete): 0,5 mm până la 20 mm
c) Lungime: în funcție de cerințele clientului
d) Standarde: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etc
e) Metoda de proces: ERW, EFW etc

Glisoare care arată trei articole pe diapozitiv.Utilizați butoanele înapoi și următorul pentru a vă deplasa prin diapozitive sau butoanele controlerului de diapozitive de la sfârșit pentru a vă deplasa prin fiecare diapozitiv.
Celulele crestei neurale craniene (CNCC) se desprind din pliurile neuronale embrionare și migrează către arcadele faringiene, care formează majoritatea structurilor mediane ale feței.Disfuncția CNCC joacă un rol important în etiologia despicăturii orofaciale, o malformație congenitală frecventă.Mutații heterozigote SPECC1L au fost găsite la pacienții cu despicaturi atipice și sindromice.Aici, raportăm o colorare îmbunătățită a componentelor joncțiunii adezive canonice (AJ), β-catenina și E-cadherina în celulele de distrugere SPECC1L cultivate, iar micrografiile electronice arată difuzia apicală-bazală a AJ.Pentru a înțelege rolul SPECC1L în morfogeneza cranio-facială, am creat un model de șoarece cu deficit de Specc1l.Mutantele homozigote sunt letale embrionare și prezintă tulburări de închidere a tubului neural și laminare CNCC.Colorarea proteinei AJ este crescută în pliurile neuronale mutante.Acest defect AJ este în concordanță cu un defect în delaminarea CNCC, care necesită dizolvarea AJ.În plus, mutanții Specc11 au redus semnalizarea PI3K-AKT și au crescut apoptoza.In vitro, inhibarea ușoară a semnalizării PI3K-AKT în celulele de tip sălbatic a fost suficientă pentru a induce modificări AJ.Este important că modificările AJ induse de distrugerea SPECC1L pot fi inversate prin activarea căii PI3K-AKT.Luate împreună, aceste date sugerează că SPECC1L, ca un nou regulator al semnalizării PI3K-AKT și al biologiei AJ, este necesar pentru închiderea tubului neural și stratificarea CNCC.
Celulele crestei neurale craniene (CNCC) se localizează la neuroectodermul dorsal și se desprind de neuroepiteliul pliurilor neuronale în curs de dezvoltare printr-un proces care implică tranziția epitelial-mezenchimală (EMT)1,2,3.CNCC-urile epiteliale premigrate perturbă joncțiunile intercelulare și devin CNCC-uri mezenchimale migratoare care umplu primul și al doilea arcade faringiene și formează cea mai mare parte a cartilajului cranio-facial.Astfel, genele care reglează funcția CNCC sunt adesea perturbate în etiologia anomaliilor congenitale cranio-faciale, cum ar fi crăpăturile orofaciale, care afectează cel mai frecvent 1/800 de nașteri numai în SUA.Una dintre deformările congenitale8.
Delaminarea CNCC coincide cu închiderea tubului neural anterior între 8,5 și 9,5 zile de dezvoltare embrionară la șoareci.Mutanții unui număr de gene asociate cu despicatură orofacială de șoarece prezintă, de asemenea, o formă de defect al tubului neural, inclusiv Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 și Pdgfrα12.Cu toate acestea, procesele de închidere a tubului neural și stratificarea CNCC pot fi considerate independente, deoarece șoarecele mutant Splotch (Pax3) prezintă defecte în închiderea tubului neural fără niciun efect asupra stratificării sau migrației CNCC 13,14.Modele suplimentare de șoarece cu defecte în disecția CNCC și închiderea tubului neural vor ajuta la delimitarea bazei moleculare comune a acestor două procese.
Izolarea CNCC din celulele neuroepiteliale necesită dizolvarea joncțiunilor adezive (AJ), care sunt compuse din complexe proteice care conțin, printre altele, E-cadherină, β-catenina, α-E-catenina și α-actinină asociate cu filamente de actină 2 Studiile de supraexpresie E-cadherina în pliurile neuronale au arătat o reducere sau întârziere a delaminării CNCC.În schimb, suprimarea E-cadherinei are ca rezultat stratificarea timpurie15,16.Mulți dintre factorii care mediază EMT în timpul stratificării CNCC sunt factorii de transcripție (AP2α, Id2, FOXD3, SAIL, TWIST, SOX10) și proteinele de remodelare a matricei extracelulare (ECM), cum ar fi metaloproteinazele matriceale (MMP), cu toate acestea CNCC-urile sunt regulatorii AJ citoscheletici direcți. încă necunoscut.Calea PI3K-AKT este cunoscută că antagonizează nivelurile de E-cadherină, în principal din cercetarea cancerului17.Studii recente au arătat că pierderea semnalizării PI3K-AKT pe bază de PDGFα la șoareci duce la anomalii cranio-faciale, inclusiv la nivelul palatului despicat și defecte ale tubului neural12.Cu toate acestea, relația dintre calea PI3K-AKT și stabilitatea AJ la stratificarea CNCC este neclară.
Am identificat anterior SPECC1L ca prima genă mutantă la două persoane cu o despicătură severă care se extinde de la gură la ochi, cunoscută sub numele de despicătură oblică (ObFC) sau despicătură Tessier IV18.Mutațiile SPECC1L au fost identificate în două familii multigeneraționale cu sindromul Opitz G/BBB autosomal dominant (OMIM #145410), în care indivizii afectați au prezentat hiperdistanță și despicătură de buză/palati19 și într-o familie cu sindrom de supradistanță Tibi (OMIM #145420)20 .mai mult de jumătate din cazurile de sindrom Opitz G/BBB sunt legate de X (OMIM #300000) și sunt cauzate de mutații ale genei MID1, care codifică proteina 22 a scheletului celular asociat cu microtubuli.Emitem ipoteza că SPECC1L, de asemenea, o proteină asociată cu microtubuli și citoscheletul de actină, poate media semnalizarea necesară pentru remodelarea citoscheletului de actină în timpul aderării și migrării celulelor 18 .Prin studii in vitro și in vivo, descriem acum SPECC1L ca un nou regulator al stabilității AJ prin semnalizarea PI3K-AKT.La nivel celular, deficiența SPECC1L a dus la o scădere a nivelului proteinei pan-AKT și o creștere a dispersiei apical-bazale a AJ, care a fost eliminată prin activarea chimică a căii AKT.In vivo, embrionii cu deficit de Specc11 prezintă o închidere deteriorată a tubului neural și disecție CNCC redusă.Astfel, SPECC1L funcționează în semnalizarea bazată pe adeziunea celulară foarte reglementată necesară pentru funcția CNCC normală în timpul morfogenezei faciale.
Pentru a caracteriza rolul SPECC1L la nivel celular, am folosit linia celulară stabilă de osteosarcom descrisă anterior U2OS, deficitară în SPECC1L18.Aceste celule U2OS stabile cu deprimare a SPECC1L (kd) au avut o scădere moderată (60-70%) a nivelurilor de transcripte și proteine ​​SPECC1L, împreună cu defecte în migrarea și reorganizarea citoscheletului de actină 18. În schimb, o scădere tranzitorie severă a S-a demonstrat că SPECC1L duce la defecte mitotice 23 .La o caracterizare ulterioară, am constatat că celulele noastre stabile SPECC1L-kd au schimbat morfologia la un grad foarte mare de confluență (Figura 1).Celulele de control individuale și celulele kd la confluență joasă au arătat similare (Figura 1A, D).La 24 de ore după fuziune, celulele de control și-au păstrat forma cuboidală (Fig. 1B, E), în timp ce celulele SPECC1L-kd s-au alungit (Fig. 1C, F).Amploarea acestei modificări a formei celulei a fost surprinsă prin imagistica în direct in vivo a celulelor de control și a celulelor kd (filmul 1).Pentru a determina rolul SPECC1L în celulele confluente, am examinat mai întâi expresia acestuia.Am descoperit că nivelurile de proteină SPECC1L au crescut la fuziune (Figura 1G), în timp ce nivelurile de transcript SPECC1L nu au crescut (Figura 1H).În plus, pe măsură ce densitatea celulară a crescut, proteina SPECC1L s-a acumulat la granițele intercelulare (Fig. 2A-E), cu un model suprapus cu cel al β-cateninei asociate membranei (Fig. 2A'-E').Având în vedere asocierea SPECC1L cu ​​citoscheletul de actină 18,23, am emis ipoteza că SPECC1L interacționează cu joncțiunile adezive pe bază de actină (AJ).
(AF) Celulele SPECC1L knockdown (DF) se alungesc la confluență mare (F) în comparație cu celulele U2OS de control (AC).Aici sunt prezentate trei dintre cele șase momente de timp (T1, T3, T6) pe care le-am selectat pentru diferite densități de celule.(G) Analiza Western blot care arată că proteina SPECC1L este stabilizată la un grad ridicat de confluență în comparație cu un grad scăzut de confluență în celulele de control.Western blot din SPECC1L arată banda așteptată de 120 kDa și o bandă cu greutate moleculară mai mare, posibil modificată post-translațional (*).Analiza Western blot a fost efectuată în aceleași condiții pentru confluență scăzută și mare.Imaginile care arată SPECC1L la confluență joasă și înaltă au fost luate din aceeași pată.Aceeași pată a fost îndepărtată și reexaminată cu anticorp p-actină.(H) Analiza cantitativă RT-PCR nu a arătat modificări semnificative ale nivelurilor de transcript SPECC1L.Barele de eroare reprezintă SEM din patru experimente independente.
(AE) Am ales șase momente de timp (T1-T6) reprezentând o gamă de densități celulare pentru a normaliza analiza formei celulei și modificările AJ în celulele U2OS cu deprimare SPECC1L (kd).Primele cinci dintre aceste momente au inclus celule unice (T1), fuziunea 50-70% a grupurilor de celule mici (T2), fuziunea fără remodelarea celulelor kd (T3), remodelarea celulelor kd (T4) și modificări de 24 de ore.în forma posterioară a celulelor kd (T5).Proteina SPECC1L a fost dispersată predominant în citoplasmă la T1 (A), dar acumularea sa a fost observată la granițele intercelulare în momentele de timp ulterioare (B-E, săgeți).(FJ) β-catenina prezintă o acumulare similară la granițele intercelulare asociate cu complexul AJ.(A'-E') SPECC1L și β-catenina prezintă colorare suprapusă la marginile celulelor la densitate celulară mare (săgeți).(F'-J') În celulele SPECC1L-kd, colorarea cu β-catenină pare normală la o densitate celulară scăzută (F'-H'), dar se extinde pe măsură ce forma celulei se schimbă (I', J'; săgeți), indicând faptul că AJ s-au schimbat.Bare = 10 µm.
Apoi am încercat să determinăm efectul deficienței SPECC1L asupra AJ.Am folosit mai mulți markeri asociați AJ, inclusiv componentele canonice F-actin, miozina IIb, β-catenina și E-cadherin24,25,26,27.Fibrele de stres de actină au crescut în celulele SPECC1L-kd așa cum s-a descris anterior (Fig. 3A, B) 18.Miozina IIb asociată cu filamentele de actină a arătat o creștere similară a celulelor SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).β-catenina asociată AJ se leagă de cadherină la nivelul membranei celulare, prezentând un model normal de expresie „fagure” în cubocitele de control (Fig. 3E, G).Interesant, în imaginile plate folosind microscopie confocală, colorarea cu β-catenină (Fig. 3E, F) și E-cadherin (Fig. 3G, H) pe membrana celulară a celulelor confluente cu deficit de SPECC1L a arătat modele proeminente de colorare extinsă.Această expansiune a colorării β-cateninei asociate cu AJ în celulele kd a fost cel mai pronunțată la confluență, dar a părut să preceadă modificările formei celulei (Fig. 2F-J, F'-J').Pentru a determina natura fizică a acestei colorări AJ extinse, am examinat marginile celulelor de pe suprafața apicală-bazală a celulelor SPECC1L-kd U2OS prin microscopie electronică de transmisie (TEM) (Figura 3I, J).Spre deosebire de celulele de control (Fig. 3I), care aveau regiuni dense de electroni separate, indicative pentru AJ (săgeți), celulele kd (Fig. 3J) au prezentat regiuni mari, contigue, de densitate mare de electroni, indicative pentru AJ de-a lungul planului apicobazal..În plus, pe secțiuni transversale, am observat pliuri extinse ale membranei celulare în celulele kd (Fig. S1A, B), ceea ce explică modelul extins al benzilor de colorare cu β-catenină și E-cadherină (Fig. 3F, H).În sprijinul rolului SPECC1L în AJ, β-catenina a fost co-imunoprecipitată cu SPECC1L în lizate de celule U2OS confluente (Fig. 3K).Împreună cu imunocolorarea extinsă pentru markerii AJ, analiza TEM a fost în concordanță cu ipoteza noastră că deficiența SPECC1L crește densitatea și varianța apical-bazală AJ.
(AH) Creșterea colorării cu F-actină în celulele kd la 48 de ore după fuziune (T6; A, B).Colorarea alterată a miozinei IIb asociată cu F-actină (C, D).Modelul neted al colorării membranei cu β-catenină și E-cadherină în celulele de control (E, G) a fost îmbunătățit în celulele SPECC1L-kd (F, H).Bare = 10 µm.(I–J) Micrografii electronice care observă joncțiunea intercelulară apical-bazală.Celulele de control prezintă regiuni dense de electroni distincte care indică joncțiuni lipicioase (I, săgeți).În schimb, întreaga joncțiune apical-bazală din celulele SPECC1L-kd a apărut densă de electroni (J, săgeți), indicând o densitate crescută și dispersie a joncțiunilor adezive.(K) β-catenina a fost co-imunoprecipitată cu SPECC1L în lizate de celule U2OS confluente.Imagine luată dintr-un loc reprezentând unul dintre cele patru experimente independente.
Pentru a înțelege rolul SPECC1L în morfogeneza cranio-facială, am creat un model de șoarece cu deficit de Specc1l folosind două linii celulare capcane ES independente, DTM096 și RRH048 (BayGenomics, CA), care reprezintă intronul 1, iar transcrierile Specc1l au fost capturate la 15 (Fig. 1) .4A, figura S2).Locația genomică a inserției vectorului momeală a fost determinată prin secvențierea întregului genom și confirmată prin PCR (Fig. S2).Ambele modele de capcană genetică au permis, de asemenea, fuziunea în cadru a reporterilor Specc11-lacZ la capturare.Prin urmare, expresia lacZ determinată prin colorarea X-gal a fost utilizată ca indicator al expresiei Specc11.Ambele alele au prezentat modele similare de expresie lacZ, capcana genei DTM096 din intronul 1 prezentând o expresie mai puternică decât RRH048 în intronul 15 (neprezentat).Cu toate acestea, Specc1l este exprimat pe scară largă, cu expresie deosebit de puternică în pliurile neuronale la E8.5 (Figura 4B), în tubul neural și procesele faciale la E9.5 și E10.5 (Figura 4C, D) și în membrele în curs de dezvoltare la E10.5 și ochi (Figura 4D).Am raportat anterior că expresia SPECC1L în primul arc faringian la E10.5 a fost prezentă în epiteliu și mezenchimul subiacent18, în concordanță cu descendența CNCC.Pentru a testa expresia SPECC1L în CNCC, am efectuat pliuri neuronale E8.5 (Figura 4E-J) și secțiuni de craniu E9.5 (Figura 4K-).La E8.5, SPECC1L a colorat intens pliurile neuronale (Fig. 4E, H), inclusiv celulele colorate cu markeri NCC (Fig. 4G, J).La E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) a colorat puternic CNCC migrator co-colorat cu AP2A (Fig. 4L, M) sau SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Reprezentare schematică a genei Specc11 de șoarece care arată inserția vectorului momeală în clonele celulare ES DTM096 (intronul 1) și RRH048 (intronul 15).(BD) colorarea lacZ a embrionilor heterozigoți Specc1lDTM096 reprezentând expresia Specc1l de la E8.5 la E10.5.NE = neuroectoderm, NF = pliu neural, PA1 = primul arc faringian.(EP) Imunocolorarea SPECC1L cu ​​markeri NCC AP2A și SOX10 în pliurile neuronale E8.5 (NF; EJ) și secțiunile de craniu E9.5 (KP).Colorarea SPECC1L a fost observată pe scară largă în pliurile neuronale E8.5 (E, H; vârfuri de săgeți), inclusiv celulele marcate cu AP2A (F, G; vârfuri de săgeată) și SOX10 (I, J; vârfuri de săgeți).La E9.5, CNCC-urile migratoare SPECC1L au colorat puternic (K, N; săgeți) etichetate AP2A (L, M; săgeți) și SOX10 (O, P; săgeți).
Încrucișarea între șoarecii heterozigoți Specc1lDTM096/+ și Specc1lRRH048/+ arată că cele două alele capcane de gene nu sunt complementare și că heterozigoții compuși și homozigoții embrionari pentru oricare alele capcanei genice sunt letale embrionare (Tabelul S1).Rapoartele mendeliane au indicat o scădere a ratei de supraviețuire a heterozigoților la naștere (așteptată 1,34 vs. 2,0).Am observat o mortalitate perinatală scăzută în rândul heterozigoților, unii au avut anomalii cranio-faciale (Fig. S3).Cu toate acestea, penetranța scăzută a acestor fenotipuri cranio-faciale perinatale face dificilă studierea mecanismelor lor fiziopatologice subiacente.Prin urmare, ne-am concentrat asupra fenotipului letal embrionar al mutanților Specc11 homozigoți.
Majoritatea embrionilor mutanți compuși heterozigoți sau homozigoți Specc1lDTM096/RRH048 nu s-au dezvoltat după E9.5–10.5 (Figurile 5A–D), iar tubul neural nu s-a închis anterior (Fig. 5B, D) și uneori s-a închis posterior (nu este prezentat) ..Acest defect de închidere a tubului neural cranian a fost asociat cu majoritatea DLX2 marcate CNCC rămase în pliurile neuronale la E10.5, indicând nicio disecție (Figura 5A'-D').Pentru a determina dacă dimensiunea totală a CNCC a fost, de asemenea, redusă, am etichetat liniile CNCC cu GFP în liniile noastre capcane genice cu Wnt1-Cre și ROSAmTmG.Transmitem în flux GFP+ NCC și GFP- (RFP+) non-NCC din embrioni întregi.La E9.5, proporția CNCC-urilor marcate cu GFP sortate în flux nu s-a schimbat semnificativ între WT și embrionii mutanți (neprezentați), indicând specificația CNCC normală.Prin urmare, am emis ipoteza că colorarea reziduală cu Wnt1-Cre și DLX2 în pliurile neuronale expuse (Figura 5B') s-a datorat stratificării CNCC defectuoase, posibil din cauza densității sau dispersiei crescute a celulelor AJ, așa cum se observă în celulele SPECC1L-kd.Am folosit markerii NCC SOX10, AP2A și DLX2 pentru a confirma prezența CNCC în pliul neural (Figura 5E-R).La E8.5, colorarea pliurilor neuronale pentru toți cei trei markeri NCC a fost observată în secțiuni ale WT (Fig. 5E, G, I) și Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).La E9.5, în timp ce markerii NCC au colorat NCC migrator în secțiunile WT (Fig. 5M, O, Q), colorarea reziduală a NCC a fost observată în pliurile neuronale expuse ale embrionilor mutanți Specc1l (Fig. 5N, P, R).Deoarece SOX10 și DLX2 marchează CNCC-urile migratoare, acest rezultat sugerează că CNCC-urile cu deficit de SPECC1L ating specificațiile post-migrație, dar nu reușesc să migreze din pliurile neuronale.
Deficiența Specc11 duce la închiderea defectuoasă a tubului neural, delaminarea celulelor crestei neurale craniene și a AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrion care poartă celule migratoare ale crestei neurale craniene (CNCC) marcate cu Wnt1-Cre (A').În schimb, embrionii mutanți Specc11 prezintă pliuri neuronale deschise (B), vârfuri de săgeți) și CNCC care nu au migrat (B', vârfuri de săgeți).(C, D') Imagini de câmp luminos (C, D') și imunocolorare (C', D') ale markerului CNCC DLX2 al embrionilor E10.5 WT (C, C') și Specc1l (D, D').La embrionii WT E10.5, CNCC DLX2-pozitiv colonizează arcadele branhiale (C’, săgeți), în timp ce la mutanți, colorarea vizibilă persistă în pliurile neurale deschise (D’, săgeți) și în primele arcade faringiene (D’, săgeți).) cu unele colorări (săgeți) care indică o slabă delaminare și migrare a CNCC.ER) Secțiunile de embrioni mutanți WT și Specc1l în stadiile E8.5 (E-L) și E9.5 (M-R) au fost etichetate cu markeri NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) și DLX2 (I, J, Q, R).La E8.5, colorarea NCC a fost observată în pliul neural de tip sălbatic (NF) și secțiunile mutante.Co-colorarea SOX10 și β-catenina în E8.5 WT (K) și mutantul (L) a evidențiat o colorare crescută a β-cateninei la granițele celulare din pliurile neuronale.La E9.5, a fost observată colorarea de tip sălbatic a CNCC-urilor migratoare (M, O, Q), în timp ce la mutanți, CNCC-urile nestratificate au colorat pliuri neuronale deschise (N, P, R).(S-Z) Analiză in vivo de etichetare AJ în secțiunile coronale ale embrionilor WT și Specc11DTM096/RRH048 cu mutația E9.5.Un plan de secțiune aproximativ este afișat în colțul din dreapta sus.În secțiuni de țesuturi mutante, a fost observată o colorare crescută a actinei F (S, T) și miozinei IIb (U, V).Similar cu rezultatele in vitro din Fig. 3, la embrionii mutanți, s-a observat o colorare îmbunătățită a membranei pentru β-catenină (W, X) și E-cadherină (Y, Z).(AA-BB) O micrografie electronică a unei secțiuni a unui embrion de tip sălbatic care privește dincolo de granița celulei apicale-bazale arată o regiune densă de electroni distinctă care indică joncțiunile adezive (AA, săgeți).În schimb, în ​​secțiuni de embrioni mutanți Specc11 (BB, săgeți), întreaga joncțiune apicobazală este densă de electroni, indicând o densitate și o dispersie crescute a joncțiunilor adezive.
Pentru a ne testa ipoteza că stratificarea redusă se datorează modificării AJ, am examinat etichetarea AJ în pliurile neuronale expuse ale embrionilor mutanți Specc1l (Fig. 5S-Z).Am observat o creștere a fibrelor de stres de actină (Fig. 5S, T) și o localizare crescută concomitentă a colorării miozinei IIB pe fibrele de actină (Fig. 5U, V).Important, am observat o colorare crescută a β-cateninei (Fig. 5W, X) și E-caderinei (Fig. 5Y, Z) la granițele intercelulare.Am examinat, de asemenea, colorarea cu β-catenină a NCC în pliurile neuronale ale embrionilor E8.5 (Fig. 5K, L).Colorația cu β-catenină pare să fie mai puternică în pliurile neuronale mutante Specc1l (Fig. 5L și K), sugerând că au început modificările AJ.În micrografiile electronice ale secțiunilor de craniu ale embrionilor E9.5, am observat din nou o colorare difuză densă de electroni crescută la embrionii mutanți Specc1l în comparație cu WT (Fig. 5AA, BB și S1E-H).Luate împreună, aceste rezultate susțin rezultatele noastre in vitro în celulele SPECC1L-kd U2OS și sugerează că colorarea aberantă AJ precede stratificarea CNCC în embrionii noștri mutanți.
Având în vedere relația antagonistă cunoscută dintre activitatea AKT și stabilitatea E-cadherinei,17,28 am emis ipoteza implicării semnalizării PI3K-AKT.În plus, am observat vezicule subepidermice la unii dintre embrionii noștri mutanți care au scăpat de letalitate (<5%) la E9,5-10,5 și, în schimb, s-au stabilit în jurul valorii de E13,5 (Fig. S3).Veziculele subepidermice sunt un semn distinctiv al semnalizării reduse PI3K-AKT pe baza PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) au raportat că întreruperea activării PI3K pe bază de PDGFRα în embrionii mutanți PdgfraPI3K/PI3K are ca rezultat vezicule subepidermice, defecte ale tubului neural și fenotipuri de palat despicat.Într-adevăr, nivelurile de pan-AKT și Ser473-AKT fosforilat activ au fost reduse in vivo în țesuturile mutante Specc1l la oprirea embrionară E9.5 (Fig. 6A-D).Scăderea nivelurilor de Ser473-AKT fosforilat se poate datora în întregime scăderii nivelurilor de pan-AKT in vivo (FIG. 6E) şi in vitro (FIG. 6F).O scădere in vitro a fost observată numai atunci când celulele U2OS au fost puternic confluente cu modificări ale formei celulei și densității AJ (Figura 6D).Astfel, datele noastre sugerează că SPECC1L este un nou regulator pozitiv al semnalizării PI3K-AKT în morfogeneza cranio-facială.
(A-E) Secțiuni de craniu E8.5 (A,B) și E9.5 (C,D) sau lizate E9.5 de la embrioni mutanți Specc1l (E) care prezintă niveluri de reducere a proteinei S473-AKT fosforilat activ și pan-AKT , în comparație cu controlul WT.Western blotting a fost efectuat pe lizate de tip sălbatic și lizate mutante în aceleași condiții.Imaginile afișate pentru SPECC1L au fost luate dintr-o pată.Aceeași pată a fost îndepărtată și reexaminată cu anticorpi anti-pan-ACT și p-actină.Nivelurile Pan-AKT în pliurile neuronale E8.5 (A, B) și nivelurile de S473-AKT fosforilat în secțiunile craniului E9.5 au fost reduse semnificativ.(F) Nivelurile Pan-AKT au fost reduse în mod similar în lizatele celulelor SPECC1L-kd U2OS recoltate la confluență ridicată.Barele de eroare reprezintă SEM din trei cuantificări Western blot independente.(GJ) Secțiuni de embrioni WT la E9.5 colorate cu KI67 și, respectiv, caspaza 3 scindată, prezentând proliferare celulară (G, G') și activitate apoptotică mică (H, H').Embrionii mutanți Specc11 prezintă o proliferare celulară comparabilă (I), dar numărul de celule care suferă apoptoză este semnificativ crescut (J).
Apoi am examinat markerii de proliferare și apoptoză.Nu am observat nicio diferență în proliferarea embrionilor E9.5 (Fig. 6E, G comparativ cu I) cu un indice de proliferare de 82,5% pentru mutanții WT și 86,5% pentru mutanții Specc1l măsurați prin colorarea KI67 (p <0,56, Fisher's). test exact).În mod similar, nu am observat nicio diferență în apoptoza măsurată prin colorarea pentru caspaza 3 scindată în pliurile neuronale la E8.5 până la oprirea embrionului (nu este prezentat) (nu este prezentat).În schimb, apoptoza a fost semnificativ crescută la toți embrionii mutanți E9.5 (Fig. 6F, H și J).Această creștere generală a apoptozei este în concordanță cu semnalizarea PI3K-AKT redusă și letalitatea embrionară timpurie29,30,31.
În continuare, pentru a confirma un rol cauzal pentru semnalizarea PI3K-AKT în modificările AJ în celulele noastre kd, am modificat chimic calea în celulele de control și kd (Figura 7A-F).Am folosit ca marker fenotipul modificării formei celulei observat în celulele SPECC1L-kd confluente, pe care l-am cuantificat utilizând raportul dintre cea mai lungă dimensiune (lungime) și dimensiunea verticală corespunzătoare (lățime).Este de așteptat un raport de 1 pentru celulele relativ rotunde sau cuboidale (Figura 7G).În plus față de forma celulei, am confirmat și efectul asupra AJ prin colorarea cu β-catenină (Fig. 7A'-F').Inhibarea căii PI3K-AKT folosind wortmannin a fost suficientă pentru a schimba forma celulelor în celulele de control (Figura 7A, C) și AJ (Figura 7A').Activatorul PI3K-AKT SC-79 nu a afectat forma celulei (FIG. 7A, E) sau expansiunea AJ (FIG. 7A') în celulele de control.În celulele SPECC1L-kd, suprimarea suplimentară a căii PI3K-AKT a dus la creșterea apoptozei (Fig. 7B, D) și o creștere marcată a colorării cu β-catenina (Fig. 7B'), în concordanță cu mutanții noștri grei in vivo.Foarte important, activarea căii PI3K-AKT a îmbunătățit semnificativ forma celulei (Figura 7B, F) și fenotipurile AJ (Figura 7B”).Schimbările în forma celulei au fost cuantificate ca raport de rotunjime celulară (CCR) și comparate pentru semnificație așa cum este descris mai sus (FIG. 7G).Într-adevăr, în celulele de control (Fig. 7G, CCR = 1,56), tratamentul cu wortmannin a fost suficient pentru a modifica semnificativ forma celulei (Fig. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) într-o măsură similară cu cea observată. în SPECC1L.-kd celule (Fig. 7G, CCR = 3,46).Tratamentul cu wortmannin al celulelor SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3,60, neglijabil) nu a fost mai semnificativ decât celulele kd netratate (Fig. 7G, CCR = 3,46, neglijabil) sau celulele martor tratate cu wortmannin (Fig. 7G)., CCR = 3,46, neglijabil) afectează suplimentar alungirea celulei (7G, CCR = 3,61, neglijabil).Cel mai important, activatorul SC-79 AKT a restabilit fenotipul alungit al celulelor SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Aceste rezultate confirmă faptul că SPECC1L reglează semnalizarea PI3K-AKT și sugerează că o scădere moderată a SPECC1L afectează aderența celulară, în timp ce o scădere puternică duce la apoptoză (Fig. 8).
(A-F') Control (A, C, E) și celule SPECC1L-kd (B, D, F) tratate cu inhibitor al căii PI3K-AKT wortmannin (C, D) sau activator SC-79 (E, F) Tratament .Celulele martor netratate sunt cuboidale (A) cu colorare celulară β-cat normală (A'), în timp ce celulele kd sunt alungite (B) cu colorare β-cat crescută (B').După suprimarea căii PI3K-AKT, celulele de control s-au alungit (C) cu expansiune β-cat (C'), în timp ce celulele kd au început să sufere apoptoză (D), similar cu embrionii noștri foarte mutați și prezentând β-cat extrem de îmbunătățit.colorare (D').După activarea căii PI3K-AKT, celulele de control au rămas cuboidale (E) și au avut o colorare normală β-cat (E'), în timp ce celulele kd au prezentat o formă semnificativ îmbunătățită a celulei (F) și colorare β-cat (F'), indicând (G) Gradul de modificare a formei celulei în (AF) a fost cuantificat utilizând raportul de rotunjime a celulei (CCR) al celei mai lungi dimensiuni (lungime) și dimensiunea verticală corespunzătoare (lățime) folosind software-ul MetaMorph.Celulele SPECC1L-kd netratate (NT) (CCR = 3,46) au fost semnificativ mai lungi decât celulele de control (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).Inhibarea de către must a căii PI3K-AKT în celulele de control a fost suficientă pentru a provoca o alungire similară a formei celulei (CCR=3,61, p<2,4×10-9).În mod similar, activarea AKT de către SC-79 în celulele SPECC1L-kd a restabilit alungirea celulelor la nivelurile de control (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).Tratamentul cu wortmannin al celulelor SPECC1L-kd a dus la creșterea apoptozei, dar nicio creștere suplimentară a modificării formei celulei (CCR=3,60) în comparație cu kd netratate (CCR=3,46, ns) sau celulele martor tratate cu wortmannin (3,61) observate în .ns = nu contează.Sunt afișate măsurătorile +/- SEM pentru 50 de celule.Diferențele statistice au fost calculate folosind testul t Student.
(A) Reprezentarea schematică a inhibării și activării căii PI3K-AKT care are ca rezultat modificări AJ și, respectiv, salvare.(B) Model propus pentru stabilizarea proteinei AKT prin SPECC1L.
CNCC premigratorii necesită liza AJ pentru a se separa de celulele neuroepiteliale ale pliului neural anterior1,15,32.Creșterea colorării componentelor AJ și pierderea distribuției asimetrice apico-bazale AJ în celulele cu deficit de SPECC1L atât in vitro, cât și in vivo, combinată cu proximitatea fizică a SPECC1L de β-catenina, sugerează că SPECC1L funcționează pentru a menține în mod corespunzător stabilitatea locală a AJ pentru muschii de organizare.citoscheletul de actină.Asocierea SPECC1L cu ​​citoscheletul de actină și β-catenina și creșterea numărului de filamente de actină condensate în absența SPECC1L este în concordanță cu creșterea observată a densității AJ.O altă posibilitate este ca un număr crescut de fibre de actină în celulele cu deficit de SPECC1L să conducă la o schimbare a tensiunii intercelulare.Deoarece stresul celular afectează dinamica AJ 33, modificările de tensiune pot avea ca rezultat AJ 34 mai difuz.Deci orice modificare va afecta straturile CNCC.
Wnt1 este exprimat în pliurile neuronale timpurii care dau naștere la celulele crestei neurale.Astfel, trasarea descendenței Wnt1-cre marchează atât pre- și migrarea NCC35.Cu toate acestea, Wnt1 marchează, de asemenea, clonele de țesut cerebral dorsal derivate și din pliurile neuronale timpurii 35,36, ceea ce face probabil ca colorarea noastră a mutanților E9.5 pentru markerii Wnt1 din pliurile neuronale deschise să nu fie CNCC.Colorarea noastră pozitivă pentru markerii NCC AP2A și SOX10 a confirmat că pliurile neuronale expuse ale embrionilor mutanți Specc11 conțineau într-adevăr CNCC.În plus, deoarece AP2A și SOX10 sunt markeri ai NCC cu migrare timpurie, colorarea pozitivă a indicat că aceste celule sunt CNCC post-migratoare care nu pot fi stratificate de E9.5.
Datele noastre sugerează că reglarea moleculară a AJ de către SPECC1L este mediată de semnalizarea PI3K-AKT.Semnalizarea AKT este redusă în celulele și țesuturile cu deficit de SPECC1L.Constatările lui Fantauzzo et al.sprijină un rol direct pentru semnalizarea PI3K-AKT în morfogeneza cranio-facială.(2014) au arătat că lipsa activării semnalizării PI3K-AKT pe bază de PDGFRα duce la un fenotip de palat despicat.De asemenea, arătăm că inhibarea căii PI3K-AKT este suficientă pentru a schimba AJ și forma celulei în celulele U2OS.În concordanță cu constatările noastre, Cain și colab.37 a arătat că reglarea în jos a subunității PI3K α110 în celulele endoteliale are ca rezultat o creștere similară a colorării β-cateninei pericelulare, denumită o creștere a „indicelui de conectivitate”.Cu toate acestea, în celulele endoteliale ale căror filamente de actină sunt deja foarte organizate, suprimarea căii PI3K-AKT are ca rezultat o formă de celule libere.În schimb, celulele SPECC1L-kd U2OS au prezentat o formă de celule alungită.Această diferență poate fi specifică tipului de celulă.În timp ce suprimarea semnalizării PI3K-AKT afectează permanent citoscheletul de actină, efectul asupra formei celulei este determinat de modificările tensiunii cauzate de modificările densității și organizării fibrelor centrale de actină.În celulele U2OS, am folosit doar modificările formei celulei ca marker al modificării și recuperării AJ cu deficit de SPECC1L.În concluzie, emitem ipoteza că inhibarea căii AKT în deficiența SPECC1L crește stabilitatea AJ și reduce delaminarea în CNCC.
Interesant, nivelurile pan-AKT au fost reduse in vitro și in vivo, în plus față de nivelurile fosforilate de 473-AKT în absența SPECC1L, sugerând reglarea semnalizării PI3K-AKT la nivelul stabilității sau al turnover-ului proteinei AKT.Genele SPECC1L și MID1, ambele asociate cu sindromul Opitz/GBBB, codifică proteine ​​care stabilizează microtubulii 18,22.Mecanismul prin care SPECC1L și MID1 mediază stabilizarea microtubulilor nu este pe deplin înțeles.În cazul SPECC1L, această stabilizare include acetilarea îmbunătățită a unui subset de microtubuli 18 .Este posibil ca SPECC1L să folosească un mecanism similar pentru a stabiliza alte proteine, cum ar fi AKT.S-a demonstrat că acetilarea resturilor de lizină din proteina AKT duce la o scădere a localizării membranei și a fosforilării38.În plus, ubiquitinarea lanțului K63 la același reziduu de lizină pe AKT este necesară pentru localizarea și activarea membranei sale39,40.Printre câțiva factori care interacționează cu proteinele SPECC1L identificați în diferite ecrane cu două hibride de drojdie de mare capacitate, patru - CCDC841, ECM2942, APC și UBE2I43 - au fost implicați în schimbarea sau stabilitatea proteinelor prin ubiquitinare sau sumoilare.SPECC1L poate fi implicat în modificarea post-translațională a resturilor de lizină AKT, afectând stabilitatea AKT.Cu toate acestea, rolul critic al SPECC1L în localizarea și stabilitatea proteinei AKT rămâne de elucidat.
Defecte severe ale expresiei SPECC1L in vivo au dus la o colorare crescută a markerului AJ și o suprapunere defectuoasă a CNCC, precum și la creșterea apoptozei și a letalității embrionare timpurii.Rapoartele anterioare au arătat că mutanții de șoarece cu niveluri crescute de apoptoză sunt asociați cu defecte ale tubului neural 44,45,46,47 și defecte cranio-faciale48.S-a sugerat că moartea excesivă a celulelor în pliurile neuronale sau arcadele faringiene poate duce la un număr insuficient de celule necesare pentru o mișcare morfogenetică adecvată 48,49,50.În schimb, liniile noastre celulare cu deficit de SPECC1L cu ​​expresie SPECC1L moderat redusă au arătat doar modificări AJ fără dovezi ale morții celulare crescute.Cu toate acestea, inhibarea chimică a căii PI3K-AKT în aceste celule Kd a dus la creșterea apoptozei.Astfel, o scădere moderată a expresiei sau funcției SPECC1L asigură supraviețuirea celulară.Acest lucru este în concordanță cu observația că embrionii mutanți Specc11 rari care scapă de arest la st.E9.5 — probabil datorită eficienței reduse de captare a genelor — sunt capabili să-și închidă tuburile neurale și să se oprească mai târziu în dezvoltare, adesea cu defecte cranio-faciale (Fig. S3).De asemenea, în concordanță cu aceasta este apariția rară a embrionilor Specc1l heterozigoți cu anomalii cranio-faciale – probabil datorită eficienței crescute de captare a genelor – precum și descoperirea la peștele zebra în care unul dintre cei doi ortologi SPECC1L (specc1lb) cauzează fenotipuri embrionare tardive, inclusiv pierderea maxilarele inferioare și despicături bilaterale51.Astfel, mutațiile heterozigote cu pierdere a funcției SPECC1L identificate la pacienții umani pot provoca mici deteriorări ale funcției SPECC1L în timpul morfogenezei cranio-faciale, suficiente pentru a explica despicaturile lor orofaciale.Reglarea pe bază de SPECC1L a contactelor intercelulare poate juca, de asemenea, un rol în palatogeneză și fuziunea arcadelor faringiene.Studii suplimentare ale funcției SPECC1L vor ajuta la elucidarea rolului contactelor intercelulare temporare în CNCC în timpul închiderii tubului neural în motilitatea celulelor neuroepiteliale și morfogeneza cranio-facială.
Controlul osteosarcomului U2OS și celulele SPECC1L-kd au fost descrise anterior (Saadi și colab., 2011).Anticorpii împotriva SPECC1L au fost, de asemenea, caracterizați anterior (Saadi și colab., 2011).Anticorpi anti-β-catenină (iepure; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (șoarece; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozină IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherină (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspaza 3 scindată (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) și β-actină (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a fost folosit așa cum este descris..Filamentele de actină au fost colorate cu rodamină faloidină Acti-stain (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Celulele de control U2OS și celulele SPECC1L-kd au fost cultivate în DMEM standard de glucoză ridicată suplimentat cu ser fetal bovin 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Pentru modificările AJ, 2 x 105 celule au fost însămânțate pe sticlă tratată cu gelatină porcină 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și au fost observate pentru modificări ale formei celulei.Celulele au fost colectate la diferite momente de timp indicate: 4 ore după însămânțare (t = 1), 24 de ore după însămânțare (t = 2), confluență fără modificarea formei celulei (t = 3), modificarea formei celulei (t = 4) , 24 ore după schimbarea formei celulei (t = 5) și 48 ore după schimbarea formei celulei (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Pentru a modula calea PI3K-AKT, celulele au fost cultivate la concentrațiile indicate cu inhibitorul PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) sau activator SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Mediul care conținea substanțele chimice a fost schimbat zilnic.
Înregistrările cadru cu cadru au fost făcute pe celule de control live și KD în condiții normale de cultură, iar imaginile cu contrast de fază au fost colectate la fiecare 10 minute timp de 7 zile.Imaginile au fost obținute folosind un microscop inversat Leica DM IRB controlat de computer echipat cu o treaptă mecanică și un obiectiv N-PLAN de 10 × conectat la o cameră QImaging Retiga-SRV.În timpul imagistică, culturile celulare au fost menținute la 37°C într-o atmosferă umedă cu 5% CO2.
Două linii celulare ES capcane genice DTM096 și RRH048 de la Centrul Regional de Resurse pentru Mouse Mutant (UC Davis, CA) au fost utilizate pentru a genera linii de șoarece cu deficit de Specc11, denumite Specc1lgtDTM096 și Specc1lgtRRH046.Pe scurt, celulele 129/REJ ES au fost injectate în blastociste C57BL6.Șoarecii masculi himerici rezultați au fost crescuți cu șoareci femele C57BL6 pentru a identifica descendenții cu colorarea blanii agouti.Prezența inserțiilor de vector capcană genică a fost utilizată pentru a identifica heterozigoți.Șoarecii au fost ținuți pe un fundal mixt de 129/REJ; C57BL6.Locația locului de inserție a vectorului capcanei genetice a fost confirmată prin RT-PCR, secvențierea genomului și complementarea genetică (Figura 1 suplimentară).Pentru a urmări descendența CNCC a șoarecilor Specc1lGT dublu heterozigoți, șoarecii ROSAmTmG (#007576) și Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) au fost încrucișați pentru a produce alela ROSAmTmG și Wnt1-Cre în mutantul Speccry1l.Toate experimentele pe șoareci au fost efectuate conform protocoalelor aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor al Centrului Medical al Universității din Kansas.
Embrionii au fost fixați în (1% formaldehidă, 0,2% glutaraldehidă, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) timp de 60 de minute la temperatura camerei.După fixarea în soluție de colorare X-gal (5 mM fericianură de potasiu, 5 mM ferocianură de potasiu, 2 mM MgCl2, 0,01% deoxicolat de sodiu, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Dezvoltarea petelor a fost efectuată la 37°C .°C în 1-6 ore.Embrionii au fost post-fixați în 4% PFA și vizualizați.
Pentru Western blot, celulele au fost lizate în tampon de liză pasivă (Promega, Fitchburg, WI) suplimentat cu un amestec de inhibitori de protează HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizatele au fost procesate pe geluri gata preparate Mini-PROTEAN TGX de poliacrilamidă 12% (Bio-Rad, Hercules, CA) și transferate pe membrane Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Membranele au fost blocate în lapte 5% în PBS conţinând 0,1% Tween.Anticorpii au fost incubați peste noapte la 4°C sau timp de o oră la temperatura camerei.Reactivul Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) a fost utilizat pentru generarea semnalului.Pentru imunocolorare, embrionii au fost fixați peste noapte în 4% PFA/PBS și crioconservați.Criosecțiile tisulare au fost blocate în PBS care conține 1% ser de capră normal (Thermo Scientific, Waltham, MA) și 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) și apoi incubate la 4°C într-un incubator în timpul noapte.cu anti-anticorp și anticorp secundar fluorescent (1:1000) timp de 1 oră la 4°C.Secțiunile colorate au fost plasate în mediu de aur ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) și imaginile plate au fost obținute folosind un microscop confocal Leica TCS SPE.Fiecare imunocolorare a fost efectuată ca trei experimente independente pe cirosecții a cel puțin doi embrioni mutanți.Este prezentat un experiment reprezentativ.
Celulele au fost incubate în tampon RIPA modificat (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCI, 10% glicerol, 2 mM EDTA și inhibitor de protează HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Pe scurt, lizatele au fost prepurificate cu perle magnetice de proteină G (Life Technologies, Carlsbad, CA) și apoi incubate peste noapte la 4°C. Cu anti-SPECC1L sau IgG s-au folosit perle de proteină G pentru extragerea SPECC1L și Western blot a fost efectuat folosind anti-SPECC1L. Anticorp -p-catenină descris mai sus. Experimentele co-IP prezentate sunt reprezentative pentru patru experimente independente.
Celulele de cultură fixe sau țesuturile embrionare de șoarece au fost furnizate centrului de microscopie electronică de la Centrul Medical al Universității din Kansas.Pe scurt, probele au fost încorporate în rășină EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizate peste noapte la 60°C și secționate la 80 nm folosind un ultramicrotom Leica UC7 echipat cu o lamă de diamant.Secțiunile au fost vizualizate folosind un microscop electronic cu transmisie JEOL JEM-1400 echipat cu un tun Lab6 de 100 kV.
Cum să citez acest articol: Wilson, NR et al.Deficiența SPECC1L duce la o stabilitate crescută a articulațiilor îmbinate și la o delaminare redusă a celulelor crestei neurale craniene.știința.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Inducerea și diferențierea crestei neurale.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR și colab.Celulele crestei neurale craniene în mișcare: rolul lor în dezvoltarea cranio-facială.Jurnalul American de Genetică Medicală.Partea A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopatia: creșterea și dezvoltarea sa în 20 de ani.Medic pediatru.patologie.laborator.medicament.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU și Noten MM Breakthrough in the genetics of orofacial clefts.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. și Riley, FM Mecanismele moleculare ale migrației și modelării celulelor crestei neurale craniene în timpul dezvoltării cranio-faciale.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH și Murray, JK Buză și palat despicătură: înțelegerea influențelor genetice și de mediu.comentariu firesc.Genetica 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR și colab.Morfogeneza anormală a pielii, membrelor și regiunii cranio-faciale la șoarecii cu deficit de factor de reglare a interferonului-6 (Irf6).National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. şi colab.Mutațiile dominante ale GRHL3 provoacă sindromul van der Waord și afectează dezvoltarea peridermei orale.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ și Juriloff, DM Actualizați lista mutanților de șoarece cu defecte în închiderea tubului neural și progresul către o înțelegere genetică completă a închiderii tubului neural.Investigarea malformațiilor congenitale.Partea A, Teratologie clinică și moleculară 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Semnalizarea PDGFRalpha mediată de PI3K reglează supraviețuirea și proliferarea în dezvoltarea scheletului printr-o cale intracelulară dependentă de p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND și Murdoch, JN Disheveled: Relația expansiunii convergente cu închiderea tubului neural.Tendințe în neurologie.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).