Componentă chimică a tubului spiralat din oțel inoxidabil 347, Identificarea proteinelor chaperone noi de antigen leucocitar uman A (HLA-A) sensibile la interferon utilizând spectrometrie de masă reticulata (CLMS)

Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Utilizați o versiune de browser cu suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).În plus, pentru a asigura suport continuu, arătăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Glisoare care arată trei articole pe diapozitiv.Utilizați butoanele înapoi și următorul pentru a vă deplasa prin diapozitive sau butoanele controlerului de diapozitive de la sfârșit pentru a vă deplasa prin fiecare diapozitiv.

Descriere produs

Tuburi spiralate din oțel inoxidabil 347L, calitate de oțel: SS347L

Sistemul de semnalizare interferon induce un răspuns puternic de citokine la o gamă largă de semnale patologice și patologice intrinseci din mediu, rezultând inducerea de subseturi de proteine ​​inductibile de interferon.Am aplicat spectrometria de masă cu legături încrucișate mediată de DSS (CLMS) pentru a detecta interacțiuni noi proteină-proteină în domeniul proteinelor induse de interferon.În plus față de proteinele inductibile de interferon așteptate, am identificat, de asemenea, noi aducti intermoleculari și intramoleculari reticulați ai proteinelor canonice inductibile de interferon, cum ar fi MX1, USP18, OAS3 și STAT1.Ne-am concentrat pe validarea ortogonală a unui nou set de rețele de proteine ​​inductibile de interferon formate de proteine ​​HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) utilizând co-imunoprecipitarea și studiul lor ulterioar utilizând modelarea dinamicii moleculare.Modelarea dinamicii conformaționale a complexului proteic a evidențiat mai multe locuri de interacțiune care reflectă interacțiunile identificate în constatările CLMS.Împreună, prezentăm un studiu pilot al CLMS pentru a identifica noi complexe de semnalizare induse de interferon și așteptăm cu nerăbdare utilizarea mai largă a CLMS pentru a identifica o nouă dinamică a interacțiunilor proteinelor în micromediul tumoral.
Înainte de a începe un răspuns imunitar adaptiv, sistemul de apărare înnăscut al gazdei montează un răspuns antimicrobian mediat de o familie de citokine alfa-helical secretate numite interferoni (IFN).Clasele de IFN de tip I IFNa și IFNp activează răspunsurile celulare, inclusiv stări antivirale, proapoptotice, proinflamatorii și antiproliferative.La om, sunt cunoscute 13 subtipuri de IFNα, toate grupate pe cromozomul 91. În mod surprinzător, doar IFNα2 a fost studiat pentru uz clinic.Recent, o atenție deosebită a fost acordată cercetărilor asupra altor subtipuri de IFNα.Un studiu recent a arătat că IFNα14 este una dintre cele mai eficiente izoforme în limitarea replicării HBV2 și HIV-13,4 în comparație cu subtipul canonic IFNα2.
S-a stabilit că complecșii receptori de interferon de tip I activați (IFNAR1 și IFNAR2) declanșează o cascadă de transducție a semnalului mediată de kinazele Janus TYK2 și JAK15,6.Aceste kinaze Janus fosforilează traductoare de semnal și activatori ai proteinei transcripționale (STAT1 și STAT2) pe reziduurile de tirozină pentru a iniția heterodimerizarea mediată de domeniul SH26.Ulterior, IRF9 leagă heterodimerii STAT pentru a forma un complex trimeric al genei factorului 3 stimulat de IFN (ISGF3), care se translocă în nucleu și induce transcripția a peste 2000 de gene stimulate de interferon (ISG)5,6,7,8.
ISG-urile formează coloana vertebrală a sistemului imunitar înnăscut, în special ca răspuns la atacul viral.Ca primă linie de apărare împotriva infecției virale, celulele desfășoară rapid interacțiuni extinse ale proteinelor celulare cu o gamă largă de activități biologice.Aceste proteine ​​includ receptori de recunoaștere a modelelor, molecule de semnalizare, factori de transcripție și proteine ​​cu funcții antivirale directe, precum și regulatori negativi ai răspunsurilor imune9.O mare parte din informațiile despre activitatea ISG provin din ecrane funcționale care utilizează ecrane de supraexpresie10,11 sau tehnici de tăcere a genelor (siRNA, ARNi și CRISPR)12,13 în care ISG-urile individuale sunt exprimate sau inhibate și activitatea lor este testată pe diferiți viruși.Deși aceste studii au determinat proprietățile antivirale ale ISG-urilor individuale, mecanismele moleculare de bază ale fiecărui ISG rămân în mare parte necunoscute.Este în general acceptat că multe proteine ​​interacționează cu una sau mai multe citokine pentru a asigura o activitate completă, astfel încât fie ISG-urile interacționează direct, fie interacțiunile lor sunt mediate de proteinele celulare.De exemplu, un studiu recent de proteomică fotoreticulat a identificat ATPaza VCP/p97 ca un partener major de interacțiune IFITM3, a cărui inhibare duce la defecte în sortarea lizozomală, turnover și cotransportul IFITM3 cu particule virale 14 .Folosind imunoprecipitarea, am identificat VAPA, o proteină asociată veziculelor, ca partener de interacțiune cu IFITM1/2/3 care mediază maturarea virală mediată de colesterol, iar acest lucru a fost confirmat de un alt studiu folosind un sistem cu două hibride de drojdie.Sprijin științific 15 , 16 .
Un proces biologic fundamental implicat în suprimarea infecției și a transformării maligne este prezentarea antigenului, care este mediată de moleculele complexului major de histocompatibilitate (MHC).Peptidele (lungime de 8-12 aminoacizi) din proteinele clivate, terminate prematur sau pliate greșit sunt încărcate în heterodimerul MHC-I (constând din lanțuri grele și ușoare ale MHC-I, numite β-2-microglobulină; β2M) 17,18.Trimerii stabili MHC-I rezultați sunt transportați la suprafața celulei, unde prezintă peptide intracelulare la celulele T CD8+ (celule T citotoxice)17.Celulele T recunosc și distrug acești agenți patogeni și celulele care poartă un antigen specific tumorii.În consecință, agenții patogeni și celulele tumorale suprimă adesea procesul de prezentare a antigenului pentru a evita supravegherea imună.În plus, MHC-I este reglat în jos în 40-90% dintre tumorile umane și este adesea asociat cu un prognostic mai prost19.
Genele implicate în răspunsul la agenții patogeni trebuie să comute rapid între o stare de repaus și o stare de transcripție activă.Prin urmare, se presupune că mai multe proteine ​​celulare sunt implicate în răspunsul la cererea mare de IFN pe perioade scurte de timp, inclusiv remodelarea și modificarea cromatinei promotorului 20,21.Cele mai multe studii s-au concentrat pe identificarea partenerilor individuali de proteine ​​ISG în prezența IFN.Mai multe studii proteomice și transcriptomice în sisteme celulare model au elucidat efectul IFN asupra peisajului celular.Cu toate acestea, în ciuda înțelegerii tot mai mari a dinamicii induse de interferoni, știm încă puține despre implicarea ISG-urilor.Când luăm în considerare complexitatea și dinamica dependentă de timp a semnalizării interferonului, apar două întrebări: (i) este posibilă stabilizarea și capcana complexelor multiproteice implicate în semnalizarea rapidă și (ii) aceste interacțiuni pot fi mapate în spațiul 3D?
Pentru a aborda aceste probleme, am implementat reticulare chimică mediată de suberat de disuccinimidă (DSS) cuplată cu spectrometrie de masă (CLMS) pentru a studia rețeaua de interacțiune a proteinelor induse de IFNα și dinamica acesteia.DSS adaugă legături covalente între resturile proximale de proteine ​​și/sau complexe proteice in vivo.Analiza MS ulterioară dezvăluie site-uri specifice de reticulare care reflectă proximitatea spațială a regiunilor dintr-o anumită proteină, numite legături interne, sau subunități în complexe de proteine, numite interrelații.Folosind această abordare, am identificat câteva noi complexe proteină-proteină, precum și rețele de interacțiune multiproteică induse de interferon.Testând în continuare un subset al acestor noi interacțiuni, demonstrăm că H2BFS (H2B de tip histonă FS; denumită în continuare H2B) și MDN1 acționează ca parteneri de legare pentru HLA-A.
Celulele Flo-1 sunt unul dintre cele mai cunoscute modele in vitro de adenocarcinom esofagian, deoarece imită caracteristicile cheie ale tumorilor esofagiene22,23.Cu toate acestea, nu toate tumorile sunt imunogene și pentru a determina dacă celulele Flo-1 răspund la tratamentul cu interferon, am tratat celulele Flo-1 cu 10 ng/ml IFNα timp de 72 de ore.Celulele Flo-1 au prezentat inducerea precoce a pSTAT1 și IRF1, începând la 2 ore după tratament și continuând timp de 72 de ore, cu o scădere dependentă de timp a nivelurilor staționare ale IRF1 (Figura 1A).ISG-urile (MX1, IFITM1, OAS1/2 și ISG15) s-au dovedit a fi puternic induse după 6 ore, mimând răspunsurile clasice de fază medie și târzie la IFNα (Figura 1A).Împreună, aceste date sugerează că acest model celular poate fi utilizat pentru a studia răspunsurile la interferon.
Răspunsuri diferențiale de exprimare a proteinei în celulele Flo-1 după tratamentul cu IFNα.(A) Expresia proteinei în celule Flo-1 tratate cu 10 ng/ml IFNa timp de 2, 6, 24, 48 și 72 de ore a fost analizată prin imunoblot folosind anticorpii ISG indicați.(B) Geluri SDS-PAGE colorate cu albastru Coomassie ale extractelor de celule întregi după reticulare cu DSS pentru timpii și concentrațiile indicate.(C) Imunoblot reprezentativ examinat cu anticorp p53(DO-1) din aceleași probe pentru a evalua gradul de reticulare a proteinei.
Pentru a capta peisajul interacțiunii proteinelor in situ, am folosit DSS, un agent de reticulare utilizat pe scară largă datorită permeabilității sale mari ale membranei și timpului de reacție relativ scurt.Timpul de reacție mai scurt ajută la prevenirea formării de agregate mari de proteine ​​reticulate, menținând astfel stabilitatea agentului de reticulare.Pentru a determina concentrația optimă de DSS și pentru a evita supra-reticulare, am expus mai întâi celulele la 5, 2,5 și 1 mM DSS timp de 5, 10, 5 și, respectiv, 30 de minute și am analizat lizatele prin SDS-PAGE colorat cu Coomassie. (datele nu sunt afișate) .Lizatele celulare par a fi foarte reticulate la cea mai mică concentrație și la cel mai scurt punct de timp.Prin urmare, DSS a fost titrat la 1, 0,5 și 0,1 mM timp de 5 minute (Figura 1B).Reticulare optimă a fost observată cu 0,5 mM DSS timp de 5 minute și aceste condiții au fost alese pentru celulele tratate cu IFNa.În plus, Figura 1C prezintă un Western blot efectuat folosind anticorpul p53 (DO-1) pentru a evalua gradul de reticulare a proteinei.
Celulele Flo-1 au fost tratate cu 10 ng/ml IFNa timp de 24 de ore înainte de adăugarea agentului de reticulare.Celulele reticulate au fost ulterior lizate prin proteoliză în două etape, iar proteinele au fost procesate de FASP (Fig. 2)24,25.Peptidele triptice reticulate au fost analizate prin spectrometrie de masă (Fig. 2).Spectrele MS/MS sunt apoi potrivite cu secvența proteinei și cuantificate cu MaxQuant26,27.Peptidele reticulate au fost identificate din spectrele obținute folosind programul SIM-XL, iar compușii individuali au fost combinați într-o rețea complexă folosind conductele software de calcul open source xQuest28 și SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifică interacțiuni proteină-proteină, lanțuri interne și lanțuri individuale în amestecuri de proteine ​​simple sau complexe și oferă scripturi pentru vizualizarea interacțiunilor în structurile proteinelor.În plus, clasifică fiecare referință încrucișată ca scor ID în funcție de calitatea spectrului MS/MS29.Au fost identificate mai multe interacțiuni și complexe proteină-proteină extrem de fiabile și un nou set de interacțiuni a fost investigat în continuare folosind co-imunoprecipitarea și modificările conformaționale ale complexelor folosind modelarea dinamicii moleculare (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Prezentare schematică a metodei CLMS.Celulele Flo-1 au fost tratate cu 10 ng/ml IFNa timp de 24 de ore, urmată de reticulare a proteinei in situ folosind DSS, urmată de liză celulară și tripsinizare.Probele reticulate au fost analizate folosind un spectrometru de masă Orbitrap și au fost prelevate în continuare pentru fragmentarea precursorilor de peptide în timpul LC-MS/MS.Două peptide legate au fost identificate din spectrele obținute folosind programul Mașina de recunoaștere a spectrului a peptidelor reticulate (SIM-XL) și toți compușii au fost combinați într-o rețea complexă folosind conducte de calcul.Filtrați interacțiunile cu încredere scăzută pe baza scorurilor ratei fals pozitive (FDR).Mai multe interacțiuni noi de înaltă fidelitate proteină-proteină au fost confirmate în continuare utilizând co-imunoprecipitarea, iar modificările conformaționale ale complexelor au fost examinate utilizând modelarea dinamicii moleculare (MD).
Un total de ~ 30.500 și ~ 28.500 de peptide au fost detectate folosind MaxQuant în probe de IFNα nestimulate și, respectiv, stimulate (Tabelul suplimentar S1, Fig. 3A).Distribuția lungimii peptidei în ambele cazuri a arătat o proporție mai mare de peptide mai mari, indicând prezența peptidelor reticulate (Fig. 3B, C).În plus, o proporție mai mare de peptide mai mari au fost prezente în intervalul 40-55 în probele tratate cu IFNα (Fig. 3C).Cartografierea proteinelor împotriva intensității log2 a arătat că proteinele clasice stimulate de interferon au fost cele mai abundente în comparație cu probele netratate, inclusiv MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 și HLA-F (Figura 3D).Analiza căilor pentru proteinele îmbogățite de mai mult de trei ori ca răspuns la tratamentul cu IFNα folosind baza de date a căilor Reactome a arătat că prezentarea și procesarea antigenului mediat de MHC-I a fost calea cea mai dominantă (Figura 3E).În conformitate cu rapoartele anterioare, răspunsurile antivirale mediate de OAS și ISG15, precum și semnalizarea IFNα/β și citokine au fost printre căile activate.În plus, legăturile proteinelor specifice lizinei și serinei au fost identificate din spectrele MS/MS dobândite inițial folosind SIM-XL.Un studiu recent a raportat 104 ISG-uri care acoperă 20 de viruși din 9 clase de virusi prin meta-analiză a studiilor individuale de supraexpresie ISG în 5 tipuri de celule9.Cu toate acestea, pentru a depăși limitările de calcul ale screening-ului seturi de date mari, am început cu un set de date mai mic pentru a explora posibilele interacțiuni între lista de gene IRDS raportate de Padaria și colab., dintre care majoritatea sunt ISG.
Identificarea proteinelor reticulate exprimate diferențial ca răspuns la IFNα (date obținute de la MaxQuant).(A) Diagrama Venn reprezentând numărul de peptide comune și exclusive identificate în probele Flo-1 tratate și netratate cu IFNα14.Distribuția lungimii peptidei a probelor reticulate netratate (B) și tratate cu IFNa (C).(D) Harta termică reprezentând log2 (intensitatea LFQ) între celulele Flo-1 netratate și tratate cu IFNα14.Panoul din stânga arată proteinele cel mai activ activate în prezența IFNa.(E) Histograma reprezentând cele 20 de căi majore de îmbogățire după tratamentul cu IFNa.Baza de date a căii Reactome a analizat modificări de mai mult de patru ori ale proteinelor care răspund la IFNα suprareglate.
Stimularea ISG mediată de interferon este bine documentată, dar la nivel molecular este puțin înțeles cum aceste proteine ​​culminează într-o gamă largă de funcții biologice.Am investigat interacțiunile proteinelor cu un grad ridicat de încredere între ISG-urile cunoscute.Interesant, am identificat o rețea care include proteine ​​MX1, USP18, ROBO1, OAS3 și STAT1 care formează un complex mare ca răspuns la tratamentul cu IFNα (Figura 4, Tabelul S2) 32,33,34.Cel mai important, aceste interacțiuni au fost găsite în toate exemplarele tratate cu IFNα și nu au fost găsite în probele netratate, ceea ce sugerează că s-au format în mod specific ca răspuns la tratamentul cu IFNα.Se știe că STAT1 reglează transcripțional expresia acestor ISG, dar interacțiunea sa cu ISG la nivel de proteine ​​nu a fost studiată.Structura cristalină a STAT1 a arătat că domeniul său elicoidal (CCD) nu este implicat în interacțiunea cu ADN sau protomeri în timpul formării dimerilor35.Aceste elice α formează o structură elicoidală care asigură o suprafață predominant hidrofilă pentru ca interacțiunile să apară 35 .În datele noastre CLMS, am observat că cele mai multe dintre interacțiunile cu STAT1 au avut loc în domeniul SH2 precedând CCD, domeniul linker sau coada C-terminală (reziduuri 700-708) (Figura 4A).Un studiu anterior a raportat că USP18 se leagă la CCD și domeniul de legare la ADN (DBD) al STAT2 și este recrutat la subunitatea receptorului de interferon de tip I IFNAR2 pentru a media inhibarea semnalizării interferonului de tip I 24 .Datele noastre au arătat, de asemenea, că domeniul catalitic USP18 interacționează cu STAT1 DBD (Figura 4A, D), sugerând că atât STAT1, cât și STAT2 pot juca un rol în atragerea USP18 la IFNAR2.
Rețeaua ISG proteină-proteină identificată în celulele reticulate tratate cu IFNa.(A) Grafic de interacțiune 2D care arată interacțiunile proteină-proteină (generate în programul SIM-XL), cu linii reprezentând interacțiuni intermoleculare (limită de reticulare setat la 3,5).Domeniile de identități diferite sunt marcate prin culoarea lor32: domeniul MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) și GED (569–660).Domeniile OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) și OAS1_C (903-108).Domeniu ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) și fn3 (777–864).Câmpurile STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) și STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Vizualizator circular al proteinelor reticulate (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 și STAT1) cu interacțiuni și interacțiuni etichetate cu albastru și, respectiv, roșu.Pragul de reticulare a fost setat la 3,5.Diagramele cu puncte indică situsurile de interacțiune STAT1 cu MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) și OAS3 (F), precum și situsurile de interacțiune K sau S între cele două peptide.În figură, pragul scorului de reticulare este setat la 3,0.(G) Diverse site-uri de interacțiune între domeniile STAT1 și OAS3 DI suprapuse pe structurile lor proteice în PyMol (sistem de grafică moleculară PyMOL, versiunea 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) și OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
Două izoforme ale USP18 au fost descrise la om, o proteină de lungime completă care este localizată predominant în nucleu și o izoformă fără domeniu N-terminal, USP18-sf, care este distribuită uniform în citoplasmă și nucleu 36 .În plus, s-a prezis că capătul N-terminal este nestructurat și nu necesită activitate de izopeptidază sau legarea ISG1537.Cele mai multe dintre interacțiunile identificate în studiul nostru au fost localizate la capătul N-terminal al proteinei, ceea ce sugerează că aceste interacțiuni implică USP18 de lungime completă (Figura 4A, D) și, astfel, apar probabil în nucleu.Mai mult, datele noastre indică, de asemenea, că capătul N-terminal este specializat pentru interacțiuni proteină-proteină.Locul de legare a IFNAR2 este situat între resturile 312-368 și, în special, niciuna dintre proteinele din complex nu se leagă la această regiune (Fig. 4A) 37,38.Aceste date luate împreună indică faptul că domeniul de legare a IFNAR2 este utilizat exclusiv de proteina receptorului.În plus, s-a descoperit că numai OAS3 și ROBO1 sunt asociate cu domenii în amonte de capătul N-terminal și site-ul de legare IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 aparține superfamiliei imunoglobulinelor (Ig) a moleculelor de semnalizare transmembranară și constă din cinci domenii Ig și trei domenii de fibronectină (Fn) în regiunea extracelulară.Aceste domenii extracelulare sunt urmate de o regiune proximală a membranei și de o singură spirală transmembranară 39. O regiune intracelulară nestructurată este situată la capătul C-terminal și conține motive de secvență conservate care mediază legarea proteinei efectoare39.Regiunea care se extinde de la aminoacizi ~1100 la 1600 este în mare parte dezordonată.Am descoperit că MX1 interacționează cu ROBO1 prin Ig, Fn și domeniile intracelulare, în timp ce majoritatea interacțiunilor cu STAT1 au loc între CCD, domeniul linker și C-terminal al ROBO1 (Fig. 4A, E).Pe de altă parte, interacțiunile cu regiunile linker DI, DIII și OAS3 au fost distribuite în întreaga proteină ROBO1 (Fig. 4A).
Familia de proteine ​​oligoadenilat sintază (OAS) acceptă și leagă ARN-ul dublu catenar intracelular (ARNds), suferă modificări conformaționale și sintetizează oligoadenilați legați 2′,5′ (2-5 As) 40 .Sa constatat că dintre cele trei OAS, OAS3 prezintă cea mai mare afinitate pentru dsARN și sintetizează cea mai mică cantitate de 2-5 As, care poate activa RNaza L și, prin urmare, poate limita replicarea virală 41 .Familia OAS constă din domeniile nucleotid transferazei de tip polimerază beta (pol-β).Cercetările anterioare au arătat că activitatea catalitică a domeniului C-terminal (DIII) este dependentă de domeniul de legare a ARNds (DI), care este necesar pentru activarea OAS342.Am observat că domeniile DI și DII ale OAS3 interacționează cu CCD și o mică regiune de joncțiune între SH2 și STAT1 TAD (Figura 4A, F).Suprapunerea diferitelor site-uri de reticulare pe structura proteinei a relevat o interacțiune între foaia β și bucla STAT1 DBD și un buzunar deschis sau o cavitate formată din reziduurile 60-75 în domeniul DI al OAS3 (Fig. 4G).Orientarea proteinelor din complex a indicat, de asemenea, că niciuna dintre interacțiunile cu OAS3 nu a interferat cu capacitatea de legare a ADN-ului domeniului său DI (Fig. S1A).În plus, domeniul N-terminal al GTPasei MX1 interacționează extensiv cu domeniile DI și DIII ale OAS3 (Fig. 4A).De asemenea, am observat o interacțiune între OAS1 și MX1 în toate cele trei repetări tratate cu IFNα, unde un singur domeniu OAS1 (de asemenea activ catalitic) a interacționat cu toate cele trei domenii MX1 (Figura S2A, B).
Proteinele MX fac parte dintr-o familie mare de GTPaze asemănătoare dineinei care conțin un domeniu GTPază N-terminal care leagă și hidrolizează GTP, un domeniu intermediar care mediază auto-asamblarea și un fermoar de leucină C-terminal care acționează ca o GTPază (LZ). ).domeniul efector domeniu25,43.MX1 se leagă de subunități ale polimerazelor virale pentru a bloca transcripția genei virale43.Un ecran de drojdie raportat anterior a arătat că MX1 asociat cu PIAS1 inhibă activarea genei mediată de STAT1 prin blocarea activității de legare a ADN-ului și are, de asemenea, activitate SUMO E344,45 ligază.Aici, demonstrăm că MX1 se leagă de STAT1 (Figura 4C, D), totuși modul în care această interacțiune afectează activarea genei mediată de STAT1 ca răspuns la IFNα necesită un studiu suplimentar.În plus, am constatat, de asemenea, că MX1 a interacționat cu IFIT3 și DDX60 în toate cele trei repetiții tratate cu IFNα (Fig. S2C).
DDX60 este o helicază citoplasmatică indusă de IFN, despre care s-a raportat anterior că joacă un rol în degradarea independentă de RIG-I a ARN46 viral.El interacționează cu RIG-I și își activează semnalizarea într-o manieră specifică ligandului 46. DDX60 constă dintr-un domeniu helicază DEXD/H-Box și un domeniu helicază C-terminal care leagă ARN viral și ADN47.Majoritatea interacțiunilor sale cu MX1 și IFIT3 au loc în regiuni lungi N- și C-terminale fără domenii sau motive canonice (Fig. S2E, F).Cu toate acestea, MX1 este asociat și cu domeniul helicazei DEXD/H-Box (Fig. S2E).Proteinele din familia IFIT au copii în tandem ale unui motiv distinctiv helix-turn-helix numit repetiție tetrapeptidică (TPR).IFIT3 s-a dovedit a fi un modulator pozitiv al semnalizării RIG-I și, prin urmare, o componentă a complexului MAVS.Luate împreună, datele noastre sugerează că IFIT3 și DDX60 interacționează în principal în regiunea dintre TPR 3-6 a IFIT3 și pot juca un rol în semnalizarea RIG-I / MAVS (Fig. S2F).
Având în vedere că screening-ul întregului proteom este intensiv de calcul, apoi am analizat întreaga bază de date umană UniProt pentru prezența uneia dintre repetele tratate cu IFNα.În această replică, am găsit câteva rețele de interacțiune extrem de fiabile pentru HLA-A.Analiza căilor proteinelor identificate prin spectrele MS/MS a arătat că procesarea și prezentarea antigenului pe bază de MHC-I este calea principală indusă de interferon (Fig. 3D).Prin urmare, ne-am concentrat pe studierea interacțiunilor proteice ale moleculelor MHC-I cu un grad ridicat de încredere în toate probele reticulate.HLA constă din domenii α1, α2 și α3 și lanțuri ușoare, iar microglobulina β2 (β2m) este o proteină însoțitoare constantă49.Odată asamblat în reticulul endoplasmatic, HLA este instabil în absența liganzilor peptidici50.Canalul de legare la peptidă este format din domeniile a1 și a2 foarte polimorfe și nestructurate în formă nepeptidică și domeniul a351 relativ mai puțin polimorf.În prezența IFNα, am detectat doi complexe HLA-A: unul interacționează cu HMGA1 și H2B (Figura 5, Tabelul S3) și celălalt interacționează cu MDN1, LRCH4 și H2B (Figura 6).
IFNα induce o rețea de interacțiune HLA-A cu H2B (H2BFS) și HMGA1.(A) Grafic 2D (generat în software-ul SIM-XL) care ilustrează diferite tipuri de interacțiuni în complexul H2B-HLA-A-HMGA1: interconectare (albastru), interconectare (roșu) și legătură unică (negru)..Domeniile de identități diferite sunt codificate cu culori32: H2B (histone; 2–102) și MHC-I (MHC_1; 25–203, grupul C1; 210–290 și MHC_I_C; 337–364).Pragul de reticulare a fost setat la 3,5.Graficele cu puncte indică situsurile de interacțiune HLA-A cu H2B (B) și HMGA1 (C), precum și situsurile de interacțiune K sau S între cele două peptide.În figură, pragul scorului de reticulare este setat la 3,0.(D) Relații dintre proteinele prezentate în structurile proteinelor H2B, HLA-A și HMGA1 din programul PyMOL.Aceste structuri au fost modelate folosind serverul Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), iar structurile șablon pentru proteinele H2B, HLA-A și HMGA1 au fost 1kx552, 1kj349 și, respectiv, 2eze55.
IFNα induce o rețea de interacțiune HLA-A cu H2B (H2BFS), MDN1 și LRCH4.(A) Legături încrucișate intramoleculare (roșu) și intermoleculare (albastru) prezentate pe o hartă interactivă 2D (generată în software-ul SIM-XL) cu MDN1 reprezentat ca un cerc.Pragul de reticulare a fost setat la 3,5.Domeniile de identități diferite sunt codificate cu culori32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grup C1; 210–290 și MHC_I_C; 337–364) și LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) și CH (535–641)).(B) Relații dintre proteinele prezentate în structurile proteinelor H2B, HLA-A, LRCH4 și MDN1 din programul PyMOL.Aceste structuri au fost modelate folosind serverul Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) cu structuri șablon 1kx552, 1kj349, 6hlu62 și 6i2665 pentru proteinele H2B, HLA-A, LRCH4 și MDN1, respectiv.Diagrame cu puncte care arată site-urile de interacțiune K sau S pentru HLA-A cu H2B (C), LRCH4 (D) și MDN1 (E).Pentru grafice, pragul scorului de legături încrucișate a fost setat la 3,0.
Pe lângă menținerea integrității genomului, histona H2B este, de asemenea, implicată în reglarea transcripției.Proteina H2B constă dintr-un domeniu histon central (HFD) format din trei elice α separate prin bucle și o coadă C-terminală 41,52.Cea mai mare parte a interacțiunii cu H2B are loc în helixul α1, care asigură trimerizarea cu heterodimerul HFD (Fig. 5A,B).Deși lizinele sunt implicate în legarea ADN-ului, unele lizine sunt, de asemenea, site-uri alternative de acetilare sau metilare.De exemplu, reziduurile K43, K46 și K57 din H2B nu sunt implicate în legarea directă a ADN-ului, dar sunt ținte ale diferitelor modificări post-transcripționale53.În mod similar, reziduurile K44, K47 și K57 din H2B pot juca un rol alternativ în prezența IFNa, inclusiv interacțiunile cu alte proteine ​​(Fig. 5A, B).În plus, histona extracromozomială H2B activează răspunsul imun în diferite tipuri de celule, acționând ca un senzor citosol pentru a detecta fragmente de ADN dublu catenar (dsDNA) derivate din agenți infecțioși sau din celulele deteriorate54.În prezența virusurilor ADN, epuizarea H2B a inhibat producția de IFN-β și fosforilarea STAT154.De asemenea, se știe că H2B se deplasează în și din nucleu mai repede decât alte histone de bază54.Interacțiunile H2B cu MDN1 și LRCH4 au fost de asemenea observate în probele netratate selectate.Am descoperit că HLA-A a interacționat cu H2B în toate cele trei probe tratate cu IFNα și într-o probă repetată netratată.Aceste date reflectă rolul H2B într-o funcție fiziologică alternativă independentă de reglarea transcripțională.
HMGA1 (grupul de mobilitate ridicată AT-Hook 1), o nucleoproteină mică, bogată în aminoacizi care promovează bolile, a fost identificată în asociere cu HLA-A.Are o coadă C-terminală acidă și trei DBD distincte numite cârlige AT, deoarece se leagă de canelura minoră a regiunii bogate în AT din dsDNA55,56.Această legare face ca ADN-ul să se îndoaie sau să se îndrepte, permițând factorilor de transcripție canonici să acceseze secvența sa consens.Se crede că coada C-terminală este implicată în interacțiunile proteină-proteină și în recrutarea factorilor de transcripție, deoarece mutanții de deleție C-terminal nu sunt capabili să inițieze transcripția57.Mai mult, acest domeniu conține mai multe situsuri de fosforilare conservate care sunt substraturi cunoscute pentru kinaze 58 .Am observat interacțiuni HLA-A și H2B cu HMGA1 în afara domeniului C-terminal, sugerând că domeniul C-terminal este utilizat în principal pentru legarea factorului de transcripție (Fig. 5A, C).Proteinele HMGA concurează cu histona H1 pentru legarea la ADN-ul adaptor, crescând astfel accesibilitatea57.În mod similar, se pare că HMGA interacționează cu histona H2B de-a lungul ADN-ului linker în competiție cu histona H1.HMGB1 induce expresia HLA-A, -B și -C în celulele dendritice, ducând la activarea acestora59, dar o interacțiune între HMG și HLA nu a fost raportată anterior.Am descoperit că HMGA1 interacționează cu domeniile α1 și α3 ale HLA-A, majoritatea interacțiunilor în afara celor 3 DBD ale sale (Figura 5A, C).În mâinile noastre, s-a descoperit că HLA-A este localizat în nucleu (datele nu sunt prezentate) și având în vedere că H2B și HMGA1 sunt de asemenea prezente în nucleu, această interacțiune are loc probabil în nucleu.Aductii specifici măsurați între H2B, HLA-A și HMGA1 sunt prezentați în Figura 5D.
Cele mai multe interacțiuni ale HLA-A cu alte proteine ​​apar în domeniile sale α1 și α2 și domeniul dezordonat C-terminal (Fig. 6).Într-unul dintre aceste exemple, am descoperit că HLA-A interacționează cu coada N-terminală dezordonată a LRCH4 (Figura 6A, D).LRCH4 reglează activarea TLR4 și inducerea citokinei LPS, modulând astfel răspunsul imun înnăscut60,61.Este o proteină membranară cu nouă repetiții bogate în leucină (LRR) și un motiv de omologie cu calmodulină (CH) în ectodomeniul său, urmat de un domeniu transmembranar (TMD) 60, 62.S-a raportat că domeniile CH mediază interacțiunile proteină-proteină 60 .O întindere de aproximativ 300 de aminoacizi între domeniile LRR și CH este relativ accesibilă, dar dezordonată.Pe baza funcției regiunilor dezordonate ca mediatori ai rețelelor proteină-proteină și ai transportului vezicular 63, am constatat că majoritatea interacțiunilor proteice au loc în regiunile dezordonate.Interacțiunile cu MDN1 au fost distribuite pe toată lungimea proteinei, inclusiv domeniile LRR1, LRR6, CH și regiuni aleatoare, în timp ce H2B s-a legat în principal la domeniul CH (Fig. 6A, B).În mod remarcabil, niciuna dintre interacțiuni nu a inclus TMJ, ceea ce sugerează specificul abordării CLMS (Figura 6A, B).
MDN1 a fost, de asemenea, identificat ca parte a rețelei de proteine ​​HLA-A (Figura 6A).Aparține familiei de proteine ​​AAA (ATPaze asociate cu diferite activități).Acesta este același domeniu AAA N-terminal care se organizează într-un inel hexameric și elimină factorul de asamblare din subunitatea ribozomală 60S 64.pare a fi similar cu dineina64,65,66.În plus, regiunea bogată în Asp/Glu este urmată de domeniul MIDAS (situs dependent de ioni metalici).Datorită dimensiunii mari a MDN1 (aproximativ 5600 de aminoacizi) și omologiei sale limitate cu proteinele bine studiate, se știe puțin despre structura și funcția sa la om.Am identificat HLA-A, H2B și LRCH4 ca parteneri de legare a MDN1 și am dezvăluit orientarea lor ca complexe proteice în PyMol (Fig. 6A, B).Aceste trei proteine ​​interacționează cu domeniul AAA, domeniul linker asemănător dineinei și, eventual, domeniul MIDAS MDN1.Într-un raport anterior, purificarea prin afinitate a proteinelor de momeală a identificat MDN1 ca o proteină asociată cu histona H2B67.În plus, un studiu recent a raportat, de asemenea, o interacțiune între MDN și HLA-B în celulele HCT116 folosind spectrometrie de masă purificată prin afinitate, susținând descoperirile noastre68.Identificarea acestui complex în probele tratate cu IFNα sugerează un rol pentru MDN1 în semnalizarea interferonului.
Deoarece genele HLA sunt foarte polimorfe, am extras citirile de secvențiere care mapează HLA-A, -B și -C din datele de secvențiere ARN ale celulelor Flo-1 (datele nu sunt afișate).Secvențele de peptide în concordanță cu citirea de secvențiere au evidențiat diferențe semnificative între HLA-A, -B și -C în regiunile în care peptidele reticulate au fost localizate în HLA-A (Figura S3).În plus, nu am observat reticulare proteină-proteină a moleculelor HLA-B/C cu proteinele H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Acest lucru sugerează că interacțiunea proteinelor găsite între HLA-A, MDN1, LRCH1 și HMGA1 este specifică HLA-A.În plus, analiza proteomică a probelor nereticulate (Tabelul S4) a arătat că HLA-A are o acoperire mai mare a secvenței în comparație cu HLA-B sau HLA-C.Peptidele identificate pentru HLA-A au avut o intensitate ridicată atât în ​​probele tratate cu IFNα, cât și în cele netratate.
Pentru a ne asigura că interacțiunile identificate aici nu s-au datorat legăturilor încrucișate nespecifice a două proteine ​​în proximitate spațială strânsă, am confirmat în continuare doi noi factori de interacțiune HLA-A prin efectuarea de teste de co-imunoprecipitare.Interacțiunile HLA-A cu MDN1 și H2B endogene au fost detectate atât în ​​celulele Flo-1 tratate cu IFNα, cât și în cele netratate (Figura 7, Figura S4).Am confirmat că HLA-A a fost capturat de H2B în imunoprecipitate și că această asociere s-a datorat tratamentului cu IFNα, deoarece HLA-A a fost absent în probele de imunoprecipitate din celulele netratate (Figura 7A).Cu toate acestea, datele noastre sugerează că IFNα reglează diferențial legarea HLA-A de H2B și MDN1.IFNα induce asocierea între H2B și HLA-A, dar reduce asocierea sa cu MDN1.Am descoperit că MDN1 a fost asociat cu HLA-A la controale, iar adăugarea de IFNα a redus această interacțiune independent de inducerea MDN1 de către IFNα (Figura 7B, C).În plus, imunoprecipitarea HLA-A a capturat H2B în celulele A549 (Fig. S4), sugerând că această interacțiune este independentă de tipul de celulă.Luate împreună, aceste rezultate susțin interacțiunile mediate de interferon ale HLA-A cu H2B și MDN1.
HLA-A co-purifică H2B și MDN1.Imunobloturile H2B (A) și MDN1 (B) endogene reprezentative au fost imunoprecipitate din celule Flo-1 tratate cu IFNa și testate pentru anticorpii indicați.IgG de șoarece și iepure au fost utilizate ca martor negativ.(C) Cantitățile relative (intrare) de diferiți antigeni sunt descrise prin imunoblot sondate împotriva anticorpilor indicați, β-actina a fost utilizată ca control de încărcare.
Au fost investigate proprietățile structurale ale uneia dintre rețelele reticulate extrem de fiabile induse de interferon, H2B-HLA-A-HMGA1.Am folosit modelarea dinamicii moleculare ca o abordare alternativă pentru a înțelege dinamica conformațională a proteinelor implicate în acest complex (Figura 8).Deducerile din datele CLMS sugerează posibilitatea unor conformații diferite ale proteinelor H2B, HLA-A și HMGA1.Prin urmare, următoarele complexe potențiale au fost modelate într-un mediu de solvent: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A și H2B-HLA-A-HMGA1.Un ecran inițial de andocare proteină-proteină folosind pachetul MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) a sugerat posibile conformații care diferă între aceste proteine ​​(Fig. 8A).Vizualizarea complexului de proteine ​​de andocare a dezvăluit mai multe interacțiuni și conformații posibile (Figura 5A, 8).Astfel, o conformație posibilă este prezentată în Figura 8A (cu legături încrucișate etichetate) și a fost evaluată în continuare folosind conducta de modelare MD.În plus, legarea H2B sau HMGA1 la HLA-A evidențiază afinitatea mai mare a H2B pentru HLA-A (Fig. 8A).
Dinamica conformațională a rețelelor posibile dintre complexele H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A și H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Panoul din stânga este o hartă 2D (generată în software-ul SIM-XL) a legăturilor încrucișate intramoleculare (roșu) și intermoleculare (albastru) (limită de reticulare setată la 3,5).În plus, reziduurile de reticulare identificate sunt marcate pe structurile proteinelor H2B, HLA-A și HMGA1.Conformațiile asociate acestor proteine ​​au fost extrase folosind conducta de andocare implementată în pachetul MOE.Panoul din stânga jos arată diferitele conformații posibile ale complexelor H2B-HLA-A și HMGA1-HLA-A cu diferite afinități de legare proteină-proteină (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Abaterea standard (RMSD) a pozițiilor atomice (excluzând atomii de hidrogen) pentru fiecare structură proteică.(C) Interacțiunile intermoleculare proteină-proteină de hidrogen din diferite complexe simulate luând în considerare interacțiunile specifice de durată ≥ 10 ns.Distanța de limită donor-acceptor a legăturii h a fost setată la 3,5 Å, iar unghiul de limită donor-acceptor H a fost setat la ≥ 160°–180°.(D) Reziduuri marcate care formează interacțiuni proteină-proteină HLA-A cu partenerii lor respectivi, care se întinde pe ≥ 20 ns, extrase din complexe HLA-A-H2B și HLA-A-HMGA1 inactiv.Structurile proteice reprezintă o structură medie de 100 ns MDS.(E) Interacțiuni între complexele HLA-A-H2B și HLA-A-HMGA1 în comparație cu interacțiunile urmărite prin simularea H2B-HLA peste 100 ns pe baza situsului de interacțiune K sau S dintre cele două peptide.Complexe /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Valoarea prag pentru evaluarea legăturilor încrucișate a fost setată la 3,0 și au fost luate în considerare interacțiunile specifice de la MDS care au ≥ 10 ns.Structurile proteinelor au fost vizualizate folosind pachetele BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, SUA) și Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
Stabilitatea moleculelor HLA-A în timp (abatere standard; RMSD sau abatere standard; RMSF) a indicat că prezența proteinelor H2B sau HMGA1 în complexe a stabilizat HLA-A (Figura 8B, Figura S5).Proteina HMGA1 se leagă strâns de situsul B2M al HLA-A, inducând stabilitatea aminoacizilor HLA-A din complexul HLA-A-HMGA1 sau H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).în special, resturile HLA ~60-90 şi ~180-210 s-au dovedit a fi mai puţin flexibile în prezenţa H2B (FIG. 8B).H2B și HMGA1 au arătat o legare mai bună la HLA-A în complexul H2B-HLA-A-HMGA1 în comparație cu legarea HLA-A la H2B sau HMGA1 singur (Figura 8C, D; Tabelul S5).Reziduurile implicate în legăturile de hidrogen (modelul MD cu ocupare ridicată ≥ 10 ns) coincid cu locurile de interacțiune CLMS (reziduuri K sau S) din complex, ceea ce sugerează că interacțiunile identificate de CLMS sunt foarte fiabile.Fiabilitate (Fig. 8E).În modelarea CLMS și MD, resturile HLA-A între aproximativ 190-210 și aproximativ 200-220 de aminoacizi s-au găsit că leagă H2B și respectiv HMGA1 (FIG. 8E).
Interacțiunile proteină-proteină formează rețele structurale dinamice care mediază comunicarea intracelulară ca răspuns la anumiți stimuli.Deoarece multe abordări proteomice detectează modificări ale nivelului general de stare de echilibru al unei proteine, dinamica interacțiunii proteină-proteină necesită instrumente suplimentare pentru a capta interfețele de legare, iar CLMS este un astfel de instrument.Sistemul de semnalizare cu interferon este o rețea de citokine care permite celulelor să răspundă la o serie de semnale patogene și patologice intrinseci ale mediului, culminând cu inducerea de subseturi de proteine ​​inductibile de interferon.Am aplicat CLMS pentru a determina dacă interacțiuni noi proteină-proteină ar putea fi identificate într-un grup de proteine ​​induse de interferon.Analiza globală de reticulare a proteinelor într-un model de celule Flo-1 sensibil la interferon a fost utilizată pentru a captura complexe de proteine.Extracția peptidelor triptice din celule nereticulate și reticulate permite numărarea peptidelor, îmbogățirea căilor și distribuția lungimii peptidei cu intensitate LFQ definită.Proteinele canonice inductibile de interferon au fost identificate ca un control intern pozitiv, în timp ce s-au observat noi aducti intermoleculari și intramoleculari reticulați ai proteinelor canonice inductibile de interferon, cum ar fi MX1, UP18, OAS3 și STAT1.Au fost investigate diverse caracteristici structurale și interacțiuni în zonele funcționale.
O interacțiune între HLA-A, MDN1 și H2B a fost detectată prin imunobblotare în celulele Flo-1 și A549 tratate și netratate cu IFNa.Rezultatele noastre evidențiază faptul că HLA-A se formează cu H2B într-o manieră dependentă de IFNα.Munca noastră reprezintă o cale interesantă pentru explorarea în continuare a co-localizării acestor două complexe.De asemenea, ar fi interesant să extindem abordarea CLMS la un panou de linii celulare pentru a identifica interacțiunile proteinelor mediate de interferon independente de tipul celular.În cele din urmă, am folosit modelarea MD ca o abordare alternativă pentru a înțelege dinamica conformațională a proteinelor implicate în complexul H2BFS-HLA-A-HMGA1, care a urmărit dialogurile intramoleculare și intermoleculare.Deducerile din datele CLMS sugerează posibilitatea unor conformații diferite ale proteinelor H2BFS, HLA-A și HMGA1.Posibilele conformații diferite dintre aceste complexe de proteine ​​de andocare au dezvăluit mai multe interacțiuni similare cu cele observate în setul de date CLMS.Unul dintre principalele puncte forte ale metodei noastre este că permite identificarea ușoară a genelor înalt polimorfe care interacționează, cum ar fi HLA, deci va fi interesant să studiem interacțiunile proteinelor specifice haplotipului HLA care altfel sunt dificil de studiat.Luate împreună, datele noastre demonstrează că CLMS poate fi utilizat pentru a ne extinde înțelegerea rețelelor de semnalizare induse de interferon și pentru a oferi o bază pentru studierea sistemelor intercelulare mai complexe în micromediul tumoral.
Celulele Flo-1 au fost obținute de la ATCC și menținute în DMEM (Gibco) suplimentat cu 1% penicilină/streptomicina (Invitrogen), 10% ser fetal bovin (Gibco) și stocate la 37°C și 5% CO2.Incubarea.Celulele au fost crescute la 70-80% confluență înainte de a fi tratate cu IFNa14 (fabricat de Edinburgh Protein Production Facility).Toate celelalte substanțe chimice și reactivi au fost achiziționate de la Sigma Aldrich, dacă nu se specifică altfel.
Celulele Flo-1 au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri și a doua zi celulele au fost tratate cu 10 ng/ml IFNa14 timp de 24 de ore până la o confluență de aproximativ 80%.Celulele au fost spălate de trei ori cu PBS și ligate cu DSS proaspăt preparat (Thermo Fisher Scientific) (dizolvat în DMSO) în PBS timp de 5 minute la 37°C până la o concentrație finală de 0,5 mM.Reacția de reticulare a DSS a fost înlocuită cu PBS și DSS rezidual a fost stins prin adăugarea a 20 mM Tris (pH 8,0) în PBS timp de 15 minute la 37°C.Celulele au fost colectate prin răzuire și colectate în tuburi cu legare scăzută (axigen).
Peletul celular a fost lizat cu 300 pl de tampon de liză a ureei (uree 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) timp de 30 de minute la temperatura camerei cu agitare ocazională.Toate etapele de centrifugare au fost efectuate la 14.000 xg la 8°C.Se centrifughează lizatul timp de 10 minute și se transferă supernatantul într-un tub nou.Particulele limpezi rămase au fost dizolvate în 150 μl din al doilea tampon de liză (2 M uree, 2% (g/v) SDS (dodecil sulfat de sodiu)) timp de 30 de minute sau mai mult până când s-a obținut o soluție apoasă omogenă.Lizatul a fost centrifugat timp de 20 de minute şi supernatantul a fost amestecat cu lizatul obţinut în etapa anterioară.Concentrațiile de proteine ​​au fost evaluate utilizând testul Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) conform instrucțiunilor producătorului pentru procedurile microplăcilor.Probele au fost congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80°C.
Aproximativ 100 μg de proteină reticulata solubilă au fost procesate folosind un protocol modificat de preparare a probei de filtrare (FASP) așa cum este descris de Wisniewski și colab.69 Pe scurt, proteina este reticulată cu 200 pl de tampon uree (uree 8 M în Tris 0,1 M, pH 8,5), agitată în vortex și înjumătățită.Toate etapele de centrifugare au fost efectuate la 14.000 xg la 25°C.Prima jumătate a lizatului de proteină reticulat a fost transferată într-un dispozitiv de filtru centrifugal Microcon de 10 kDa echipat cu o membrană Ultracel-10 (Merck), urmată de centrifugare pe filtru timp de 25 de minute.Apoi adăugați a doua jumătate a proteinei în filtru și repetați aceiași pași.Recuperarea proteinei a fost realizată prin adăugarea a 100 μl de clorhidrat de tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP) 17 mM în tampon uree.Recuperarea a fost agitată pe un termomixer la 600 rpm timp de 30 min la 37°C.În plus, coloana a fost centrifugată și proteina reticulata redusă a fost alchilată folosind 100 μl de iodoacetamidă 50 mM în tampon uree.Reacția de alchilare a fost efectuată la temperatura camerei timp de 20 de minute în întuneric.Rotiți coloana, spălați pereții coloanei de 3 ori cu 100 µl tampon de uree și apoi centrifugați.Aceeași operațiune a fost efectuată de 3 ori folosind 100 μl de bicarbonat de amoniu 100 mM.Înainte de tripsinizare, înlocuiți tubul de colectare cu unul nou.Se adaugă tampon de digestie care conține 50 mM bicarbonat de amoniu și 1 pl tripsină diluat în tampon tripsină (Promega).Raportul dintre tripsină şi proteină a fost menţinut la aproximativ 1:33, iar reacţiile de digestie au fost incubate peste noapte la 37°C într-o cameră umedă.Peptida reticulată a fost eluată din filtru prin centrifugare timp de 25 minute.Recuperarea peptidei a fost îmbunătățită prin adăugarea a 50 μl de NaCI 0,5 M la filtru, urmată de centrifugare timp de 25 de minute.
Coloanele C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) au fost utilizate pentru a desaler peptidele triptice reticulate urmând protocolul descris de Bouchal et al.70 cu modificări minore.Pe scurt, coloanele de centrifugare C18 au fost activate cu trei spălări cu acid formic 0,1% (FA) în acetonitril (AcN) (Merck) și două spălări cu 0,1% FA.Coloana a fost hidratată cu 0,1% FA timp de 15 minute.Încărcați probe în coloane de centrifugare și spălați de 3 ori cu 0,1% FA.Peptidele desarate au fost eluate secvenţial cu un gradient treptat utilizând 50%, 80% şi 100% AcN în 0,1% FA.Probele au fost uscate într-un concentrator SpeedVac Plus (Eppendorf) până când lichidul rezidual a dispărut complet.Peptidele eluate au fost dizolvate în 100 μl de acid trifluoracetic 0,08% în AcN 2,5% și concentrațiile au fost măsurate pe un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Aproximativ 1 μg de peptidă reticulată per probă a fost injectat în sistemul LC-MS/MS.
Peptidele reticulate au fost separate pe un sistem UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) conectat la un spectrometru de masă Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptidele reticulate au fost colectate pe o coloană de captură C18 u-precoloană lungă de 300 um ID, 5 mm umplută cu sorbent C18 PepMap100 și sorbent PepMap de 5 um (Thermo Scientific).Încărcați debitul pompei setat la 5 µl/min 0,08% acid trifluoracetic dizolvat în 2,5% AcN.Peptidele reticulate au fost separate pe o coloană analitică de silice topită cu un diametru interior de 75 μm și o lungime de 150 mm, umplută cu un sorbent PepMap de 2 μm (Thermo Scientific).Fazele mobile A și B au constat din 0,1% FA în apă și, respectiv, 0,1% FA în acetonitril.Gradientul începe de la 2,5% B și crește liniar la 40% B în 90 de minute, apoi la 90% B în următoarele 2 minute.Compoziţia de fază mobilă a fost menţinută la 90% B timp de 10 minute şi apoi a scăzut liniar la 2,5% B timp de 2 minute.Coloana a fost echilibrată la 2,5% B timp de 8 minute înainte de următorul ciclu.Peptidele reticulate eluate din coloana analitică au fost ionizate într-o sursă de ionizare prin nanoelectrospray (NSI) și injectate într-un spectrometru de masă Exploris 480 (Thermo Scientific).
Spectrometrul de masă Orbitrap Exploris 480 a funcționat în modul de corelare pozitivă a datelor.O scanare completă a fost efectuată în modul secțiune la o rezoluție de 120.000 cu setări de interval de la m/z 350 Th la m/z 2000 Th.Ținta AGC normalizată a fost setată la 300% cu un timp maxim de intrare de 50 ms.Detectarea vârfurilor monoizotopice a fost stabilită pentru peptide.Parametrul de relaxare a constrângerii este setat la adevărat dacă sunt găsiți prea puțini precursori.Forța ionică minimă a precursorului a fost setată la 5,0e3 și stările de încărcare a precursorului de până la +8 au fost incluse în experimente.
Timpul ciclului dintre scanările majore în modul de corelare a datelor a fost setat la 2,5 secunde.Excluderea dinamică a masei a fost setată la 20 s după prima fragmentare a ionului precursor.Fereastra de izolare a precursorului a fost setată la 2 mii.Tipul de energie de coliziune normalizată cu un mod de energie de coliziune fix a fost ales într-o scanare MS/MS dependentă de date.Energia de coliziune setată la 30%.Rezoluția Orbitrap a fost setată la 15.000 și ținta AGC la 100%.Timpul maxim personalizat de injectare este setat la 60 de milisecunde.
Înainte de a urmări rețeaua proteine-proteine ​​în probe reticulate, am procesat fișierele brute folosind pachetul MaxQuant (versiunea 1.6.12.0)26,27 pentru a identifica peptidele/proteinele urmăribile din probe.În plus, analize proteomice similare au fost efectuate pe probe Flo-1 nereticulate tratate și netratate cu IFNa.Datele MS/MS au fost căutate în baza de date umană UniProt (www.uniprot.org) (încărcat pe 12 august 2020, conține 75.093 de intrări) folosind motorul de căutare încorporat Andromeda27.Căutarea a fost efectuată fără a indica specificitatea enzimei și diferitele modificări ale deamidării (N, Q) și oxidării (M).Toleranțele de masă ale precursorului au fost stabilite la 20 ppm și ionii de produs la 0,02 Da.Deviația de masă inițială și maximă a fost setată la 10 ppm.Masa maximă a peptidei a fost stabilită la 4600 Da, iar asemănarea secvenței a fost stabilită între 7 și 25 de aminoacizi (aa).Analiza statistică ulterioară a fost efectuată utilizând programul Perseus (versiunea 1.6.10.45).Conținutul de proteine ​​a fost calculat prin normalizarea intensității spectrale a proteinei (intensitatea LFQ; cuantificare nemarcată)27, iar valorile intensității au fost convertite în Log2.O grupare ierarhică a proteinelor identificate prin intensitatea lor peptidică a fost construită folosind pachetul pheatmap (v1.0.12) în R (v 4.1.2).Analiza de îmbogățire a căilor a fost efectuată utilizând baza de date a căilor Reactome pentru proteinele tratate cu IFNα care au fost activate de mai mult de patru ori în comparație cu probele netratate.
Identificarea legăturilor încrucișate chimice specifice lizinei (K) sau serinei (S) ale complexelor proteice monitorizate prin LC-MS/MS a fost efectuată utilizând o mașină de identificare spectroscopică (SIM-XL) pentru peptide reticulate (SIM-XL)29.În primul rând, posibilele interacțiuni între genele de rezistență la deteriorarea ADN (IRDS) asociate interferonului (IFN) au fost investigate folosind setul de date despre proteine ​​IRDS descris în Padariya și colab.28.Screeningul tuturor condițiilor și repetărilor întregului UniProt uman este intensiv de calcul, astfel încât întreaga bază de date UniProt umană (www.uniprot.org) (descărcată la 12 august 2020, conține 75.093 de intrări) împotriva repetărilor tratate cu IFNα.Unul dintre filtrele pentru interacțiuni de mare încredere.Aceste interacțiuni de înaltă semnificație obținute au fost extinse și testate în toate repetările și condițiile.
În SIM-XL, DSS a fost utilizat pentru reticulant (XL), iar schimbarea greutății XL și modificarea greutății au fost setate la 138,06 și, respectiv, 156,07.Sunt considerate următoarele situsuri de reacție de reticulare: KK, KS și KN-TERM, fără ioni reporter.Atât ppm precursor, cât și fragment au fost setate la 20 și pragul Xrea a fost setat la 0,15.Tripsina a fost considerată a fi complet specifică și a fost implementată o metodă de fragmentare a capcanei C de înaltă energie (HCD).Pragul de reducere dinamică a DB XCorr și numărul minim de peptide pentru reducerea dinamică a DB au fost setate la 2,5 și, respectiv, 2.Alți parametri sunt: ​​probabilitatea monoizotopului și limitarea maximă a coincidenței, minim 4 reziduuri AA pe fir și sarcina maximă a firului și 3 maxime de divizări ratate.Hărțile 2D cusute rezultate au fost analizate în (SIM-XL) și reprezentarea grafică xQuest28 a fost utilizată pentru a construi hărțile 2D.Legăturile proteinelor pe structurile proteinelor sunt furnizate în PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versiunea 2.0 Schrödinger, LLC).
Structurile modelului de proteine ​​au fost create folosind serverul Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 folosind principiile modelării omologiei și implementării „Metodei Markov ascunse”.Phyre2 generează structuri model bazate pe alinierea secvenței cu structurile proteinelor cunoscute.Pentru proteinele H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 și MDN1, au fost utilizate structurile șablon 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 și 6i2665.În plus, a fost luată în considerare și structura AlphaFold71 MX1, UBP18 și ROBO1.Structura proteinei a fost vizualizată folosind pachetul BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, SUA) și pachetul Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).