347 12,7 * 1,24 mm Tuburi spiralate din oțel inoxidabil, mecanism molecular de condensare electrostatică sincronă și coagregare a α-sinucleinei și tau

Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Utilizați o versiune de browser cu suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).În plus, pentru a asigura suport continuu, arătăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Glisoare care arată trei articole pe diapozitiv.Utilizați butoanele înapoi și următorul pentru a vă deplasa prin diapozitive sau butoanele controlerului de diapozitive de la sfârșit pentru a vă deplasa prin fiecare diapozitiv.

Specificații țevi din oțel inoxidabil 347

347 12.7*1.24mm Tuburi spiralate din oțel inoxidabil

Diametru exterior: 6,00 mm OD până la 914,4 mm OD, Dimensiuni până la 24” NB disponibile din stoc, dimensiune OD Tuburi de oțel disponibile din stoc

SS 347 Interval de grosime a țevii: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
Greutate: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) Sau mărime neobișnuită care trebuie adaptată după cum este necesar

Tip: SS 347 Țevi fără sudură |SS 347 ERW Tevi |SS 347 Tevi sudate |SS 347 Țevi fabricate |Tuburi SS 347 CDW, țevi LSAW / sudate cu cusături / redesenate

Formă: țevi/tuburi rotunde SS 347, țevi/tuburi pătrate SS 347, țevi/tuburi dreptunghiulare SS 347, țevi spiralate SS 347, formă „U” SS 347, bobine pentru tort SS 347, tuburi hidraulice SS 347

Lungime: simplu aleatoriu, dublu aleatoriu și lungime obligatorie Capăt: capăt simplu, capăt teșit, călcat

Protecție la capăt: capace din plastic |Finisaj exterior: 2B, No.4, No.1, No.8 Finisaj în oglindă pentru țevi din oțel inoxidabil, finisaj conform cerințelor clientului

Stare de livrare: Recoacet și murat, lustruit, strălucitor recoacet, trasat la rece

Inspecție, rapoarte de testare: certificate de testare la fabrică, EN 10204 3.1, rapoarte chimice, rapoarte mecanice, rapoarte de testare PMI, rapoarte de inspecție vizuală, rapoarte de inspecție terță parte, rapoarte de laborator aprobate de NABL, raport de testare distructivă, rapoarte de testare nedistructivă

Ambalare: Ambalat în cutii de lemn, pungi de plastic, benzi de oțel la pachet sau conform solicitărilor clienților

Specialități: Dimensiunile și specificațiile, altele decât cele de mai sus, pot fi fabricate la cerere

SS 347 Interval de dimensiuni ale țevii: 1/2 inch NB, OD până la 24 inch

ASTM A312 347: Conductă austenitică sudată fără sudură și cu cusături drepte, destinată pentru temperaturi ridicate și servicii corozive generale.Metalul de adaos nu este permis în timpul sudării.

ASTM A358 347: Conductă austenitică sudată prin fuziune electrică pentru servicii corozive și/sau la temperaturi înalte.În mod obișnuit, numai conductele de până la 8 inchi sunt produse conform acestei specificații.În timpul sudării este permisă adăugarea de metal de adaos.

ASTM A790 347: Conductă feritică/austenitică (duplex) sudată fără sudură și cu cusături drepte, destinată serviciului coroziv general, cu un accent deosebit pe rezistența la fisurarea coroziunii prin efort.

ASTM A409 347: țeavă cu perete ușor austenitic cu diametru mare, sudată prin fuziune electrică cu cusătură dreaptă sau spirală, cu dimensiuni de la 14” la 30” cu pereți Sch5S și Sch 10S pentru corozive și/sau înalte

ASTM A376 347: Conductă austenitică fără sudură pentru aplicații la temperaturi înalte.

ASTM A813 347: țeavă austenitică cu cusătură simplă, sudata simplă sau dublă pentru temperaturi înalte și aplicații corozive generale.

ASTM A814 347: țeavă austenitică sudată prelucrată la rece pentru temperaturi ridicate și servicii corozive generale.

Țevi din oțel inoxidabil 347H Compoziție chimică

Proprietăți mecanice ale țevii din oțel inoxidabil 347H

Țevi din oțel inoxidabil 347H Proprietăți fizice

Clase echivalente pentru țevi din oțel inoxidabil 347H

Agregarea amiloid alfa-sinucleină (αS) este un semn distinctiv al bolii Parkinson și al altor sinucleinopatii.Recent, proteina tau asociată în mod obișnuit cu boala Alzheimer a fost asociată cu patologia αS și sa constatat că se co-localizează în incluziuni bogate în αS, deși mecanismul molecular de coagregare a celor două proteine ​​rămâne neclar.Raportăm aici că faza αS se separă în condensate lichide prin condensarea complexă electrostatică cu polipeptide încărcate pozitiv, cum ar fi tau.În funcție de afinitatea αS pentru policationi și de rata de epuizare a valenței rețelei de coagulare, cheagurile suferă o gelificare sau coalescență rapidă, urmată de o agregare lentă a amiloidului.Combinând o suită de tehnici biofizice avansate, am reușit să caracterizăm separarea fazelor αS/Tau lichid-lichid și să identificăm factorii cheie care duc la formarea de agregate eterogene care conțin ambele proteine ​​într-un condensat de proteine ​​lichide.
Pe lângă compartimentele membranare, separarea spațială în celule poate fi realizată și prin formarea de corpuri dense, bogate în proteine, asemănătoare lichidelor, numite condensate sau picături biomoleculare, printr-un proces cunoscut sub numele de separare de fază lichid-lichid (LLPS).Aceste picături sunt formate prin interacțiuni temporale multivalente, de obicei între proteine ​​sau proteine ​​și ARN și servesc o varietate de funcții în aproape toate sistemele vii.Un număr mare de proteine ​​capabile de LLP prezintă secvențe de complexitate scăzută care sunt foarte dezordonate în natură și în formarea de condensate biomoleculare3,4,5.Numeroase studii experimentale au dezvăluit natura flexibilă, adesea dezordonată și multivalentă a proteinelor care alcătuiesc aceste condensate asemănătoare lichidelor, deși se știe puțin despre determinanții moleculari specifici care controlează creșterea și maturarea acestor condensate la o formă mai solidă. stat..
Noile date susțin ipoteza că LLPS aberante determinate de proteine ​​și transformarea picăturilor în structuri solide pot fi căi celulare relevante care conduc la formarea de agregate toxice insolubile care sunt adesea semne distinctive ale bolilor degenerative.Multe proteine ​​intrinsec dezordonate (IDP) asociate cu LLPS, adesea foarte incarcate si flexibile, au fost mult timp asociate cu neurodegenerarea prin procesul de agregare a amiloidului.În special, s-a demonstrat că condensurile IDP biomoleculare, cum ar fi FUS7 sau TDP-438 sau proteinele cu domenii mari de complexitate scăzută, cum ar fi hnRNPA19, îmbătrânesc în forme asemănătoare gelului sau chiar solide printr-un proces numit fluidizare.compus.la tranziția în fază solidă (LSPT) în funcție de timp sau ca răspuns la anumite modificări post-translaționale sau mutații semnificative patologic1,7.
Un alt IDP asociat cu LLPS in vivo este Tau, o proteină dezordonată asociată cu microtubuli a cărei agregare de amiloid a fost implicată în boala Alzheimer10, dar a fost recent implicată și în boala Parkinson (PD) și alte proteinopatii nucleare sinaptice 11, 12, 13 sunt legate.S-a demonstrat că Tau se disociază spontan de soluție/citoplasmă datorită interacțiunilor electrostatice favorabile14, ducând la formarea de picături îmbogățite cu tau cunoscute sub numele de coacervate electrostatice.De asemenea, s-a observat că acest tip de interacțiune nespecifică este forța motrice din spatele multor condensate biomoleculare din natură15.În cazul unei proteine ​​tau, agregarea electrostatică poate fi formată prin agregare simplă, în care regiunile încărcate opus ale proteinei declanșează procesul de scindare, sau prin agregare complexă prin interacțiune cu polimeri încărcați negativ, cum ar fi ARN.
Recent, α-sinucleina (αS), un IDP amiloid implicat în PD și alte boli neurodegenerative cunoscute colectiv sub numele de sinucleinopatie17,18, a fost demonstrată în modele celulare și animale19,20 concentrate în condensate de proteine ​​cu comportament asemănător fluidului.Studiile in vitro au arătat că αS suferă LLPS prin simpla agregare prin interacțiuni predominant hidrofobe, deși acest proces necesită concentrații excepțional de mari de proteine ​​și timpi de incubare atipic lungi19,21.Dacă condensurile care conțin αS observate in vivo sunt formate de acest proces sau de alte procese LLPS rămâne o problemă cheie nerezolvată.În mod similar, deși agregarea amiloidului αS a fost observată în neuroni din PD și alte sinucleinopatii, mecanismul exact prin care αS suferă agregarea amiloidului intracelular rămâne neclar, deoarece supraexprimarea acestei proteine ​​nu pare să declanșeze acest proces de la sine.Este adesea necesară deteriorarea celulară suplimentară, ceea ce sugerează că anumite locații celulare sau micromedii sunt necesare pentru renuclearea ansamblurilor de amiloid αS intracelular.Un mediu celular care este deosebit de predispus la agregare poate fi interiorul condensatelor de proteine ​​23 .
Interesant, s-a descoperit că αS și tau se co-localizează în incluziunile caracteristice ale bolii la oameni cu boala Parkinson și alte sinucleinopatii 24,25, iar experimentele au raportat o relație patologică sinergică între cele două proteine ​​26,27 sugerând o potențială relație între agregarea αS și tau în bolile neurodegenerative.boală.S-a descoperit că αS și tau interacționează și promovează agregarea reciprocă in vitro și in vivo 28,29 și au fost observate agregate eterogene compuse din aceste două proteine ​​în creierul pacienților cu sinucleinopatii 30 .Cu toate acestea, se știe puțin despre baza moleculară a interacțiunii dintre αS și tau și despre mecanismul co-agregării sale.S-a raportat că αS interacționează cu tau printr-o atracție electrostatică între regiunea C-terminală extrem de încărcată negativ a αS și regiunea centrală bogată în prolină a tau, care este, de asemenea, îmbogățită în reziduuri încărcate pozitiv.
În acest studiu, arătăm că αS se poate disocia într-adevăr în picături prin condensarea complexului electrostatic în prezența proteinei tau, spre deosebire de interacțiunea acesteia cu alte polipeptide încărcate pozitiv, cum ar fi poli-L-lizina (pLK) și în acest proces.αS acționează ca o moleculă de schelă pentru rețeaua de picături.Am identificat diferențe vizibile în procesul de maturare a coacervaților αS electrostatic, care sunt asociate cu diferențe în valența și puterea interacțiunii proteinelor implicate în rețeaua de coacervați.Interesant, am observat co-agregarea proteinelor amiloide αS și tau în coacervate lichide cu viață lungă și am identificat câțiva factori cheie care duc la co-agregarea acestor două proteine ​​în astfel de coacervate.Aici descriem în detaliu acest proces, care este un posibil mecanism molecular care stă la baza colocalizării a două proteine ​​în incluziuni specifice bolii.
αS are o coadă C-terminală extrem de anionică la pH neutru (Fig. 1a) și am emis ipoteza că ar putea suferi LLPS prin condensarea complexelor electrostatice cu molecule polipeptidice dezordonate policationice.Am folosit o poli-L-lizină cu 100 de reziduuri (pLK) ca moleculă model de pornire datorită naturii sale polimerice încărcate pozitiv și dezordonate la pH neutru 32. În primul rând, am confirmat că pLK interacționează cu domeniul Ct al αS prin spectroscopie RMN prin soluție. (Figura 1b) folosind αS marcat cu 13C/15N în prezența raporturilor molare crescânde αS:pLK.Interacțiunea pLK cu domeniul Ct al αS se manifestă prin perturbări ale deplasării chimice și o scădere a intensității de vârf în această regiune a proteinei.Interesant este că atunci când am amestecat αS cu pLK la o concentrație de αS de aprox.5–25 µM în prezența polietilenglicolului (5–15% PEG-8) (tampon LLPS tipic: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) am trecut imediat printr-un câmp larg de formare a proteinelor .picăturile au fost observate folosind microscopie cu fluorescență (WF) și cu câmp luminos (BF) (Fig. 1c).Picături de 1-5 µm care conțin αS concentrat (adăugat 1 µM αS marcat AlexaFluor488, AF488-αS), proprietățile lor electrostatice pot fi derivate din rezistența lor la 10% 1,6-hexandiol (1,6-HD) și sensibilitatea sa la o creștere a concentrației de NaCl (Fig. 1c).Natura fluidă a coacervaților complexului electrostatic αS/pLK este demonstrată de capacitatea lor de a fuziona în milisecunde (Fig. 1d).Folosind turbidimetria, am cuantificat formarea picăturilor în aceste condiții, am confirmat natura electrostatică a interacțiunii principale asociate cu stabilitatea acesteia (Fig. 1e) și am evaluat efectul diferitelor rapoarte de polimeri asupra procesului LLPS (Fig. 1f).Deși formarea picăturilor este observată într-o gamă largă de rapoarte de polimeri, procesul este foarte favorabil când pLK este în exces de αS.LLP-urile au fost, de asemenea, observate folosind agentul de deplasare chimic diferit dextran-70 (70 kDa) sau folosind o varietate de formate de probă, inclusiv picături de lame de sticlă, godeuri de microplăci din diferite materiale, capilare Eppendorf sau cuarț.
o Reprezentare schematică a diferitelor regiuni de proteine ​​în variantele WT-αS și ΔCt-αS utilizate în acest studiu.Domeniul N-terminal amfipatic, regiunea hidrofobă care formează amiloid (NAC) și domeniul C-terminal încărcat negativ sunt afișate în albastru, portocaliu și, respectiv, roșu.Este afișată harta Net Charge Per Residual (NCPR) a WT-αS.b Analiza RMN a interacțiunii αS/pLK în absența aglomerărilor macromoleculare.Pe măsură ce concentrația pLK crește (raporturile molare αS:pLK de 1:0,5, 1:1,5 și 1:10 sunt afișate în verde deschis, verde și, respectiv, verde închis).c Coacervați αS/pLK (raport molar 1:10) la 25 µM (1 µM pLK marcat cu AF488 sau pLK marcat cu Atto647N pentru imagistica WF) în tampon LLPS (sus) sau suplimentat cu 500 mM NaCl (stânga jos) sau după 110 % 1,6-hexandiol (1,6-HD; dreapta jos).Bară de scară = 20 µm.d Imagini microscopice reprezentative ale fuziunii picăturilor BF de αS/pLK (raport molar 1:10) la o concentrație de 25 μM;săgețile indică îmbinarea picăturilor individuale (săgeți roșii și galbene) într-o nouă picătură (săgeată portocalie) în decurs de 200 ms).Bară de scară = 20 µm.e Difuzarea luminii (la 350 nm) agregare αS/pLK în tampon LLPS înainte și după adăugarea a 500 mM NaCl sau 10% 1,6-HD la 25 µM αS (N = 3 replicări ale probei, deviația medie și standard sunt de asemenea indicate).f Imaginea BF (sus) și analiza împrăștierii luminii (la 350 nm, de jos) a agregării αS/pLK la 25 μM αS cu creșterea raportului molar αS:pLK (N = 3 replicări ale probei, este indicată și deviația medie și standard).Bară de scară = 10 µm.Bara de scară de pe o imagine indică scara tuturor imaginilor dintr-un singur panou.Datele brute sunt furnizate sub formă de fișiere de date brute.
Pe baza observațiilor noastre despre condensarea complexului electrostatic αS/pLK și a observațiilor anterioare ale αS ca moleculă client a condensatului tau/ARN prin interacțiunea directă cu tau31, am emis ipoteza că αS și tau s-ar putea co-segrega cu solventul în absența ARN-ului. condensare.prin complexe electrostatice, iar αS este proteina de schelă în coacervatele αS/Tau (vezi distribuția sarcinii tau în Figura 2e).Am observat că atunci când 10 μM αS și 10 μM Tau441 (conținând 1 μM AF488-αS și, respectiv, 1 μM Atto647N-Tau) au fost amestecate împreună în tampon LLPS, au format cu ușurință agregate de proteine ​​care conțin ambele proteine, așa cum se observă la microscopia WF.(Fig. 2a).Colocalizarea celor două proteine ​​în picături a fost confirmată prin microscopie confocală (CF) (Fig. 1a suplimentară).Un comportament similar a fost observat atunci când dextran-70 a fost utilizat ca agent de agregare (Figura suplimentară 1c).Folosind fie PEG marcat cu FITC, fie dextran, am constatat că ambii agenți de aglomerare au fost distribuiți uniform pe probe, nefiind nici segregare, nici asociere (Fig. 1d suplimentară).Mai degrabă, sugerează că în acest sistem promovează separarea fazelor prin efecte de aglomerare macromoleculară, deoarece PEG este un agent de aglomerare preferenţial stabil, aşa cum se vede în alte sisteme LLP33,34.Aceste picături bogate în proteine ​​au fost sensibile la NaCl (1 M), dar nu la 1,6-HD (10% v/v), confirmând proprietățile lor electrostatice (Fig. 2a, b suplimentară).Comportamentul lor fluid a fost confirmat prin observarea evenimentelor de picături de fuziune în milisecunde folosind microscopia BF (Fig. 2b).
a Imagini de microscopie confocală (CF) ale αS/Tau441 coacervează în tampon LLPS (10 μM din fiecare proteină, 0,5 μM de αS marcat cu AF488 și Tau441 marcat cu Atto647N).b Imagini reprezentative de contrast de interferență diferențială (DIC) ale evenimentelor de fuziune a picăturilor αS/Tau441 (10 μM pentru fiecare proteină).c Diagrama de fază bazată pe împrăștierea luminii (la 350 nm) a LLPS Tau441 (0–15 µM) în absența (stânga) sau prezența (dreapta) a 50 µM αS.Culorile mai calde indică mai multă împrăștiere.d Difuzarea luminii a probelor LLPS αS/Tau441 cu creșterea concentrației de αS (Tau441 la 5 µM, N = 2–3 repetări ale probei, așa cum este indicat).e Reprezentare schematică a unor variante de proteină tau și diferite regiuni ale proteinei utilizate în acest studiu: domeniul N-terminal încărcat negativ (roșu), regiunea bogată în prolină (albastru), domeniul de legare a microtubulilor (MTBD, evidențiat în portocaliu) și spirală pereche formatoare de amiloid.regiuni de filament (PHF) situate în MTBD (gri).Este afișată harta taxei nete pe reziduu (NCPR) a Tau441.f Folosind αS marcat cu AF488 1 µM și ΔNt- etichetat cu Atto647N, folosind αS sau ΔCt-αS marcat cu AF488 1 µM în prezența ΔNt-Tau (sus, 10 µM per proteină) sau K18 (jos, ) ) ) micrografii ale WF condensate în tampon LLPS sau K18.Barele de scară dintr-o imagine reprezintă scara tuturor imaginilor dintr-un singur panou (20 µm pentru panourile a, b și f).Datele brute pentru panourile c și d sunt furnizate ca fișiere de date brute.
Pentru a testa rolul αS în acest proces LLPS, am investigat mai întâi efectul αS asupra stabilității picăturilor prin nefelometrie folosind concentrații crescânde de NaCl (Fig. 2c).Cu cât concentrația de sare din probele care conțin αS este mai mare, cu atât valorile de împrăștiere a luminii sunt mai mari (la 350 nm), ceea ce indică rolul stabilizator al αS în acest sistem LLPS.Un efect similar poate fi observat prin creșterea concentrației αS (și, prin urmare, a raportului αS:Tau441) la cca.Creștere de 10 ori față de concentrația tau (5 µM) (Fig. 2d).Pentru a demonstra că αS este o proteină de schelă în coacervate, am decis să investigăm comportamentul mutantului Tau perturbat de LLPS, căruia îi lipsește o regiune N-terminală încărcată negativ (reziduurile 1-150, vezi Fig. 2e) numită ΔNt-Tau.Microscopia WF și nefelometria au confirmat că ΔNt-Tau în sine nu a suferit LLPS (Fig. 2f și Fig. 2d suplimentară), așa cum a fost raportat anterior 14. Cu toate acestea, atunci când αS a fost adăugat la soluțiile de dispersie ale acestei variante de Tau trunchiate, procesul LLPS a fost complet restaurată cu densitatea picăturilor apropiată de densitatea picăturilor a soluțiilor de dimensiune completă de Tau și αS în condiții și concentrații de proteine ​​similare.Acest proces poate fi observat și în condiții de aglomerare macromoleculară scăzută (Fig. 2c suplimentară).Rolul regiunii αS C-terminale, dar nu întreaga sa lungime, în procesul LLPS a fost demonstrat prin inhibarea formării picăturilor folosind o variantă αS trunchiată C-terminală, lipsită de reziduurile 104-140 (Fig. 1a) ale (ΔCt-). αS) proteină (Fig. 2f și Fig. 2d suplimentară).Colocalizarea αS și ΔNt-Tau a fost confirmată prin microscopie cu fluorescență confocală (Fig. 1b suplimentară).
Pentru a testa în continuare mecanismul LLPS între Tau441 și αS, a fost utilizată o variantă suplimentară Tau, și anume fragmentul de miez de filament elicoidal pereche (PHF) din domeniul de legare a microtubulilor (MTBD), care dacă conține patru domenii repetate caracteristice, cunoscute și în mod obișnuit. ca fragmentul K18 (vezi Fig. 2e).S-a raportat recent că αS se leagă de preferință la o proteină tau situată într-un domeniu bogat în prolină într-o secvență care precede domeniul de legare a microtubulilor.Cu toate acestea, regiunea PHF este, de asemenea, bogată în reziduuri încărcate pozitiv (vezi Figura 2e), în special lizină (15% reziduuri), ceea ce ne-a determinat să testăm dacă această regiune contribuie și la condensarea complexului αS/Tau.Am observat că K18 singur nu a putut declanșa LLPS la concentrații de până la 100 μM în condițiile testate (tampon LLPS cu 15% PEG sau 20% dextran) (Figura 2f).Cu toate acestea, când am adăugat 50 µM αS la 50 µM K18, formarea rapidă a picăturilor de proteine ​​care conțin K18 și αS a fost observată prin nefelometrie (Figura suplimentară 2d) și microscopie WF (Fig. 2f).După cum era de așteptat, ΔCt-αS nu a putut restabili comportamentul LLPS al K18 (Fig. 2f).Remarcăm că agregarea αS/K18 necesită concentrații ușor mai mari de proteine ​​pentru a induce LLPS în comparație cu αS/ΔNt-Tau sau αS/Tau441, celelalte lucruri fiind egale.Acest lucru este în concordanță cu o interacțiune mai puternică a regiunii C-terminale αS cu domeniul Tau bogat în prolină în comparație cu domeniul de legare a microtubulilor, așa cum s-a descris anterior 31 .
Având în vedere că ΔNt-Tau nu poate efectua LLPS în absența αS, am ales această variantă Tau ca model pentru caracterizarea αS/Tau LLPS având în vedere simplitatea sa în sistemele LLPS cu Tau de lungime completă (izotip, Tau441/Tau441).cu procese de agregare complexe (heterotipice, αS/Tau441).Am comparat gradul de agregare αS (ca parte a proteinei de fază condensată, fαS,c) în sistemele αS/Tau și αS/ΔNt-Tau prin centrifugare și analiza SDS-PAGE în fază dispersată (vezi 2e), am găsit valori foarte asemănătoare pentru toate proteinele la aceeași concentrație.În special, am obținut fαS,c 84 ± 2% și 79 ± 7% pentru αS/Tau și, respectiv, αS/ΔNt-Tau, sugerând că interacțiunea heterotipică dintre αS și tau este superioară interacțiunii dintre moleculele tau.între.
Interacțiunea cu diferiți policationi și efectul procesului de condensare asupra cineticii αS au fost studiate pentru prima dată prin metoda de recuperare a fluorescenței după fotoalbire (FRAP).Am testat coacervatele αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau și αS/pLK (100 μM αS suplimentat cu 2 μM αS AF488-αS și 100 μM Tau441 sau ΔNt-Tau sau 1 mM pLK).Datele au fost obținute în primele 30 de minute după amestecarea componentelor probei.Din imaginile reprezentative FRAP (Fig. 3a, condensarea αS/Tau441) și curbele de timp corespunzătoare (Fig. 3b, Fig. 3 suplimentară), se poate observa că cinetica αS este foarte similară cu cea a coacervatelor Tau441.și ΔNt-Tau, care este mult mai rapid cu pLK.Coeficienții de difuzie calculați pentru αS în interiorul coacervatului conform FRAP (așa cum este descris de Kang și colab. 35) sunt D = 0,013 ± 0,009 µm2/s și D = 0,026 ± 0,008 µm2/s pentru αS/Tau441 și αNt-S/Δ sistemul αS/.pLK, Tau și D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respectiv (Fig. 3c).Cu toate acestea, coeficientul de difuzie αS în faza dispersată este cu câteva ordine de mărime mai mare decât toate fazele condensate, așa cum este determinat de spectroscopie de corelație de fluorescență (FCS, vezi Fig. 3 suplimentară) în aceleași condiții (tampon LLPS), dar în absența policationilor (D = 8 ± 4 µm2/s).Prin urmare, cinetica translației αS este redusă semnificativ în coacervate în comparație cu proteinele în faza dispersată din cauza efectelor pronunțate de aglomerare moleculară, deși toate coacervatele păstrează proprietăți asemănătoare lichidului în prima jumătate de oră după formarea lor, spre deosebire de faza tau.cinetică mai rapidă în condensatul pLK.
a–c Analiza FRAP a dinamicii αS (2% αS marcat cu AF488) în coacervatele electrostatice.Imaginile reprezentative ale testelor αS/Tau441 FRAP în trei exemplare sunt afișate în (a), unde cercurile roșii indică zone decolorate.Bara de scară este de 5 µm.b Curbele FRAP medii și (c) coeficienți de difuzie calculati (D) pentru 5–6 (N) picături diferite din trei experimente folosind 100 µM αS și concentrații echimolare de Tau441 (roșu) sau ΔNt-Tau (albastru) sau pLK (verde) la de zece ori concentrația de LLPS.Deviația standard a curbei FRAP este afișată în culori umbrite.Pentru comparație, coeficientul de difuzie αS în faza dispersată a fost determinat în triplicat utilizând spectroscopie de corelație cu fluorescență (FCS) (a se vedea Figura 3 suplimentară și metode pentru mai multe informații).d Spectre EPR continue în bandă X de 100 μM TEMPOL-122-αS în tampon LLPS fără polication (negru) sau în prezența a 100 μM Tau441 (roșu) sau ΔNt-Tau (albastru) sau 1 mM pLK (verde).Insertul arată o vedere mărită a liniilor puternice de câmp unde au loc cele mai dramatice schimbări.e Curbe de legare de 50 μM TEMPOL-122-αS cu diferiți policationi în absența LLPS (fără PEG).Amplitudinea redusă a benzii III în comparație cu banda II (IIII/III) a spectrului EPR normalizat se arată că crește rapoartele molare ale Tau441 (roșu), ΔNt-Tau (albastru) și pLK (verde).Liniile colorate arată potrivirea datelor folosind un model de legare brută cu n locuri de legare identice și independente pe fiecare curbă.Datele brute sunt furnizate sub formă de fișiere de date brute.
Ca o completare, am investigat dinamica αS în diferite coacervate folosind etichetarea cu spin direcționat (SDSL) și rezonanța paramagnetică a electronilor continuă (CW-EPR).Această metodă sa dovedit a fi foarte utilă în raportarea flexibilității și dinamicii IDP cu o rezoluție reziduală realistă36,37,38.În acest scop, am construit reziduuri de cisteină în unică mutantă Cys și am folosit sonda de spin 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oxil (TEMPOL).Derivații de maleimidă le etichetează.Mai precis, am introdus sonde TEMPOL în poziția 122 sau 24 αS (TEMPOL-122-αS și TEMPOL-24-αS).În primul caz, vizam regiunea C-terminală a proteinei, care este implicată în interacțiunea cu policationii.În schimb, poziția 24 ne poate oferi informații despre dinamica generală a proteinelor din condensat.În ambele cazuri, semnalele EPR obținute pentru proteinele din faza dispersată au corespuns radicalilor de nitroxizi în stare de mișcare rapidă.După separarea fazelor în prezența tau sau pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 sau ΔNt-Tau la un raport de 1:1 sau pLK la un raport de 1:10), s-a observat o creștere a intensității maxime relative în spectrul EPR al αS.Linia de pierdere s-a lărgit, indicând o cinetică redusă de reorientare a αS în picături în comparație cu proteina în fază diluată (Fig. 3d, Fig. 4a suplimentară).Aceste modificări sunt mai pronunțate la poziția 122. În timp ce la poziția 24 prezența pLK nu a afectat cinetica sondei, la poziția 122 forma liniei spectrale s-a schimbat semnificativ (Fig. 4a suplimentară).Când am încercat să modelăm spectrele la poziția 122 a două sisteme αS/polication folosind modelul izotrop (Figura suplimentară 5a) folosit în mod obișnuit pentru a descrie dinamica IDP38,39 marcată cu spin, nu am putut reconstrui spectrele experimentale..Simularea spectrală a poziției a contrastelor de 24 de rotiri (Fig. 5a suplimentară).Acest lucru sugerează că există poziții preferențiale în spațiul configurațiilor de spin ale regiunii C-terminale a αS în prezența policationilor.Când se ia în considerare fracția de αS în faza condensată în condiții experimentale de EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% și 47 ± 4% pentru αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau și, respectiv, αS/pLK - vezi Suplimentar Fig. 2e a analizei datelor c), se poate observa că lărgirea detectată prin metoda EPR reflectă în principal interacțiunea regiunii C-terminale a αS cu diferiți policationi în faza condensată (modificarea principală la utilizarea TEMPOL-122-). αS), și nu condensarea proteinelor.Se observă o creștere a microvâscozității în sondă.După cum era de așteptat, spectrul EPR al proteinei în alte condiții decât LLPS a fost complet restaurat atunci când 1 M NaCl a fost adăugat la amestec (Figura suplimentară 4b).În general, datele noastre sugerează că modificările detectate de CW-EPR reflectă în principal interacțiunea regiunii C-terminale a αS cu diferiți policationi în faza condensată, iar această interacțiune pare a fi mai puternică cu pLK decât cu Tau.
Pentru a obține mai multe informații structurale despre proteinele din coacervat, am decis să studiem sistemul LLPS folosind RMN în soluție.Cu toate acestea, am putut detecta doar fracția αS rămasă în faza dispersată, ceea ce se poate datora dinamicii reduse a proteinei în interiorul coacervatului și unei faze dense în partea de jos a soluției în analiza RMN.Când am analizat structura și dinamica proteinei rămase în faza dispersată a probei LLPS folosind RMN (Figura suplimentară 5c, d), am observat că proteina s-a comportat aproape identic în prezența pLK și ΔNt-Tau, ambele care se aflau în structura secundară și dinamica coloanei vertebrale a proteinei, relevate de experimente privind schimbarea chimică secundară și relaxarea R1ρ.Datele RMN arată că capătul C-terminal al αS suferă o pierdere semnificativă a flexibilității conformaționale, păstrând în același timp natura dezordonată, ca și restul secvenței proteinei, datorită interacțiunilor sale cu policationi.
Deoarece lărgirea semnalului CW-EPR observată în faza condensată TEMPOL-122-αS reflectă interacțiunea proteinei cu policationi, am efectuat o titrare EPR pentru a evalua afinitatea de legare a αS la diferiți policationi în absența LLPS (fără acumulare de Tampon LLPS), sugerând că interacțiunile sunt aceleași în fazele diluate și concentrate (ceea ce este confirmat de datele noastre, Fig. 4a suplimentară și Fig. 6 suplimentară).Scopul a fost de a vedea dacă toate coacervatele, în ciuda proprietăților lor comune asemănătoare fluidelor, prezintă vreun comportament diferențial la nivel molecular.După cum era de așteptat, spectrul EPR sa lărgit odată cu creșterea concentrației de polication, reflectând o scădere a flexibilității moleculare din cauza interacțiunilor moleculare ale tuturor partenerilor de interacțiune aproape până la saturație (Fig. 3e, Fig. 6 suplimentară).pLK a atins această saturație la un raport molar mai mic (polication:αS) în comparație cu ΔNt-Tau și Tau441.De fapt, compararea datelor cu un model de legare aproximativă presupunând n locuri de legare identice și independente a arătat că constanta aparentă de disociere a pLK (~5 μM) este cu un ordin de mărime mai mică decât cea a Tau441 sau ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Deși aceasta este o estimare aproximativă, aceasta sugerează că αS are o afinitate mai mare pentru policationii mai simple cu regiuni de încărcare pozitivă continuă.Având în vedere această diferență de afinitate între αS și diferiți policationi, am emis ipoteza că proprietățile lor lichide se pot schimba diferit în timp și, astfel, suferă de diferite procese LSPT.
Având în vedere mediul foarte aglomerat din coacervatul de proteine ​​și natura amiloidă a proteinei, am observat comportamentul coacervatului în timp pentru a detecta posibile procese LSPT.Folosind microscopia BF și CF (Figura 4), am observat că αS/Tau441 coacervează într-o mare măsură în soluție, formând picături mari care contactează și udă suprafața de la fundul puțului/alunecului ca picături pline, așa cum era de așteptat (Figura suplimentară). .7d);noi numim aceste structuri formate de fund „plute de proteine”.Aceste structuri au rămas fluide, deoarece au păstrat capacitatea de a fuziona (Fig. 7b suplimentară) și au putut fi văzute timp de câteva ore după declanșarea LLPS (Fig. 4 și Fig. 7c suplimentară).Am observat că procesul de umectare este favorizat pe suprafața materialelor hidrofile, mai degrabă decât hidrofobe (Figura suplimentară 7a), așa cum era de așteptat pentru coacervatele electrostatice cu sarcini dezechilibrate și, prin urmare, potențiale de suprafață electrostatice ridicate.În special, coalescența și raftingul αS/ΔNt-Tau au fost reduse semnificativ, în timp ce condensurile αS/pLK au fost reduse semnificativ (Fig. 4).În timpul scurt de incubare, picăturile de αS/pLK au fost capabile să se unească și să umezească suprafața hidrofilă, dar acest proces s-a oprit rapid și după 5 ore de incubare, s-au observat doar evenimente de coalescență limitate și nici o umezire.– tranziție gel-picurare.
BF (panouri în tonuri de gri) și CF (panouri din dreapta, αS etichetat cu AF488 în verde) ale probelor de coacervat care conțin 100 µM αS (1% etichetă fluorescentă) în tampon LLPS în prezența a 100 µM Tau441 (sus) fluorescență ΔN imagini microscopice -Tau (centru) sau 1 mM pLK (jos) la diferiți timpi de incubare și înălțimi focale (z, distanța de la fundul godeului plăcii).Experimentele au fost repetate de 4-6 ori independent unul de celălalt, cu aceleași rezultate.Coacervatele αS/Tau441 sunt umezite după 24 de ore, formând plute mai mari decât imaginea.Bara de scară pentru toate imaginile este de 20 µm.
Am întrebat apoi dacă bazinele mari de proteine ​​asemănătoare fluidului formate în αS/Tau441 LLPS ar duce la agregarea amiloidului oricăreia dintre proteinele studiate.Am urmărit maturarea picăturilor αS/Tau441 în timp cu microscopia WF în aceleași condiții ca mai sus, dar folosind αS marcat cu AF488 1 μM și Tau441 marcat cu Atto647N (Fig. 5a).După cum era de așteptat, am observat localizarea completă a proteinei pe tot parcursul procesului de maturare.Interesant, de la cca.După 5 ore, în interiorul plutelor au fost observate structuri necirculare mai intense, pe care le-am numit „puncte”, dintre care unele au fost colocalizate cu αS, iar altele au fost îmbogățite în Tau441 (Fig. 5a, săgeți albe).Aceste pete au fost întotdeauna observate în plute într-o măsură mai mare pentru αS/ΔNt-Tau decât pentru αS/ΔNt-Tau.Nu au existat pete distincte în picăturile de sisteme pLK și Tau incompetente pentru fuziune/umedare.Pentru a testa dacă aceste pete care conțin αS și Tau441 sunt agregate asemănătoare amiloidului, am efectuat un experiment similar utilizând microscopia CF în care Tau441 a fost etichetat cu Atto647N și s-a adăugat de la început 12,5 μM tioflavină specifică amiloidului (ThT).colorant.Deși colorarea cu ThT a picăturilor sau plutelor αS/Tau441 nu a fost observată nici după 24 de ore de incubație (Fig. 5b, rândul de sus - picături rămase peste plute de proteine), structurile ThT-pozitive care conțineau Atto647N-Tau441 în interiorul plutelor au fost foarte slabe.aceasta reproduce dimensiunea, forma și locația petelor descrise anterior (Fig. 5b, rândurile din mijloc și de jos), sugerând că petele pot corespunde agregatelor asemănătoare amiloidului formate în coacervatele fluide de îmbătrânire.
WF 25 μM αS la diferiți timpi de incubare și înălțimi focale (z, distanța de la fundul nelegat) în prezența a 25 μM Tau441 (1 μM AF488-etichetat αS și Atto647N-etichetat Tau441) într-un godeu al unei plăci de microscop cu tampon LLPS) .Șase experimente au fost repetate independent cu rezultate similare.b Imagine microscopică CF de 25 μM αS în prezența a 25 μM Tau441 (1 μM Tau441 marcat cu Atto647N) și 12,5 μM tioflavin-T (ThT).Picăturile de proteine ​​ponderate și plutele și petele de proteine ​​​​depuse sunt afișate în rândurile de sus și, respectiv, din mijloc.Rândul de jos arată imagini cu plute și picături din 3 replici independente.Săgețile albe indică puncte ThT-pozitive în ambele panouri.Bara de scară pentru toate imaginile este de 20 µm.
Pentru a examina mai detaliat modificările rețelei de proteine ​​coacervate în timpul tranziției de la lichid la solid, am folosit imagistica cu fluorescență pe durata de viață (FLIM) și microscopia de transfer de energie prin rezonanță Förster (FRET) (Figura 6 și figurile suplimentare 8 și 9).Am emis ipoteza că maturarea coacervată a stratului într-o structură de proteină agregată mai condensată sau chiar asemănătoare unui solid duce la un contact mai strâns între proteină și sonda fluorescentă atașată acesteia, producând potențial un efect de stingere manifestat într-o durată de viață scurtă a sondei (τ) , așa cum a fost descris anterior40.,41 ,42.În plus, pentru probele marcate dublu (AF488 și Atto647N ca coloranți donor și, respectiv, acceptor FRET), această scădere a τ poate fi, de asemenea, însoțită de condensarea coacervatului și o creștere a eficienței FRET (E) în timpul LSPT.Am monitorizat formarea plutei și a petelor în timp în probele LLPS αS/Tau441 și αS/ΔNt-Tau (25 µM din fiecare proteină în tampon LLPS care conține 1 µM AF488 marcat αS și/sau Atto647N marcat Tau441 sau ΔNt-Tau).Am observat o tendință generală în care durata de viață a fluorescenței sondelor AF488 (τ488) și Atto647N (τ647N) a scăzut ușor pe măsură ce coacervatele s-au maturizat (Fig. 6 și Fig. 8c suplimentară).Interesant, această schimbare a fost îmbunătățită semnificativ pentru punctele din plute (Fig. 6c), indicând că a avut loc o condensare suplimentară a proteinelor la puncte.În sprijinul acestui fapt, nu s-a observat nicio schimbare semnificativă a duratei de viață a fluorescenței pentru picăturile αS/ΔNt-Tau în vârstă de 24 de ore (Figura 8d suplimentară), sugerând că gelificarea picăturilor este un proces distinct de spotting și care nu este însoțit de o reorganizare moleculară semnificativă. în cadrul coacervatelor.Trebuie remarcat faptul că punctele au dimensiuni diferite și conținut variabil în αS, în special pentru sistemul αS/Tau441 (Fig. 8e suplimentară).Scăderea duratei de viață a fluorescenței spot a fost însoțită de o creștere a intensității, în special pentru Atto647N etichetat Tau441 (Figura suplimentară 8a) și eficiențe FRET mai mari atât pentru sistemele αS/Tau441, cât și αS/ΔNt-Tau, indicând o condensare suplimentară în LLPS Cinci ore după declanșare, proteinele din interiorul electricității statice s-au condensat.În comparație cu αS/ΔNt-Tau, am observat valori mai mici ale τ647N și τ488 ceva mai mari în punctele αS/Tau441, însoțite de valori FRET mai mici și mai neomogene.Posibil, acest lucru poate fi legat de faptul că în sistemul αS/Tau441, abundența αS observată și așteptată în agregate este mai eterogenă, adesea substoichiometrică în comparație cu Tau, deoarece Tau441 însuși poate suferi, de asemenea, LLPS și agregare (Figura 8e suplimentară) .Cu toate acestea, gradul de coalescență a picăturilor, formarea plutei și, mai important, agregarea proteinelor în coacervatele asemănătoare lichidelor este maxim atunci când sunt prezente atât Tau441, cât și αS.
a Imagini de microscopie cu fluorescență pe viață (FLIM) ale αS/Tau441 și αS/ΔNt-Tau la 25 μM din fiecare proteină (1 μM αS marcat cu AF488 și 1 μM Tau441 sau ΔNt-Tau marcat cu Atto647N) în .Coloanele prezintă imagini reprezentative ale probelor de LLPS la diferiți timpi de maturare (30 min, 5 h și 24 h).Cadrul roșu arată regiunea care conține pete αS/Tau441.Durata de viață este afișată ca bare de culoare.Bară de scară = 20 µm pentru toate imaginile.b Imagine FLIM mărită a zonei selectate, afișată în caseta roșie din panoul a.Intervalele de viață sunt afișate folosind aceeași scară de culori ca în panoul a.Bară de scară = 5 µm.c Histograme care arată AF488 (atașat la αS) sau Atto647N (atașat la Tau) pentru diferite specii de proteine ​​(picături-D-, plută-R- și speckle-P) identificate în imaginile FLIM înregistrate pentru αS-) durata de viață a distribuțiilor de timp a Tau441 și Probele de coacervat αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI pentru D, 29-44 ROI pentru R și 21-51 ROI pentru puncte).Valorile medii și mediane sunt afișate ca pătrate galbene și, respectiv, linii negre în interiorul casetelor.Limitele inferioare și superioare ale casetei reprezintă primul și, respectiv, al treilea quartile, iar valorile minime și maxime din intervalul intercuartil de 1,5 ori (IQR) sunt afișate sub formă de mustăți.Valorile aberante sunt afișate ca diamante negre.Semnificația statistică între perechile de distribuții a fost determinată folosind un test t cu două eșantioane, presupunând variații inegale.Valorile p testului t cu două cozi sunt afișate cu asteriscuri pentru fiecare pereche de date comparate (* valoare p > 0,01, ** valoare p > 0,001, *** valoare p > 0,0001, **** valoare p > 0,00001), ns Indică neglijabilitate (valoare p > 0,05).Valorile p exacte sunt date în Tabelul suplimentar 1, iar datele originale sunt prezentate ca fișiere de date brute.
Pentru a demonstra în continuare natura de tip amiloid a petelor/agregatelor, am tratat probe de coacervat necolorate timp de 24 de ore cu concentrații mari de (1 M) NaCl, ceea ce a dus la separarea agregatelor de coacervatele de proteine.Când au fost observate agregate izolate (adică, o soluție dispersată de agregate) folosind microscopia de forță atomică (AFM), am observat o morfologie predominant sferică cu o înălțime regulată de aproximativ 15 nm, care tinde să se asocieze în condiții de concentrație mare de sare, similară cu comportamentul fibrilelor amiloide tipice datorită efectului hidrofob puternic asupra suprafeței (rețineți că fibrilele au de obicei o înălțime de ~ 10 nm) (Figura suplimentară 10a).Interesant, atunci când agregatele izolate au fost incubate cu ThT într-un test standard de fluorescență ThT, am observat o creștere dramatică a randamentului cuantic al fluorescenței ThT, comparabilă cu cea observată atunci când colorantul a fost incubat cu fibrile amiloide αS tipice (Figura suplimentară 10b), sugerând că agregatele coacervate conțin structuri asemănătoare amiloidului..De fapt, agregatele au fost tolerante la concentrații mari de sare, dar sensibile la clorură de guanidină 4 M (GdnHCl), ca fibrilele amiloid tipice (Figura suplimentară 10c).
Apoi, am analizat compoziția agregatelor utilizând fluorescența cu o singură moleculă, spectroscopie de corelație/corelație încrucișată a fluorescenței specifice (FCS/FCCS) și analiza în explozie a detectării coincidenței în două culori (TCCD).În acest scop, am izolat agregatele formate după 24 de ore de incubare în probe LLPS de 100 μl care conțin αS și Tau441 (ambele 25 μM) împreună cu 1 μM αS marcat cu AF488 și 1 μM Tau441 marcat cu Atto647N.Se diluează soluția de agregat dispersat rezultată într-o stare monomoleculară folosind același tampon fără PEG și 1 M NaCl (același tampon utilizat pentru a separa agregatele de coacervat) pentru a preveni orice interacțiune electrostatică posibilă între LLPS și proteină.Un exemplu de traiectorie în timp a unei singure molecule poate fi văzut în Fig. 7a.Analiza FCCS/FCS (corelație încrucișată, CC și autocorelație, AC) a arătat că agregatele care conțin αS și tau au fost abundente în probe (vezi curba CC din Fig. 7b, panoul din stânga), iar un exces de proteină monomerică reziduală a apărut ca un rezultatul procesului de diluare (vezi curbele AC din Figura 7b, panoul din stânga).Experimentele de control efectuate în aceleași condiții de soluție folosind probe care conțin numai proteine ​​monomerice nu au arătat nicio curbă CC, iar curbele AC se potrivesc bine cu modelul de difuzie cu o singură componentă (Ec. 4), unde proteinele monomerice au coeficienții de difuzie așteptați (Fig. 7b). ), panoul din dreapta).Coeficientul de difuzie al particulelor agregate este mai mic de 1 µm2/s, iar cel al proteinelor monomerice este de aproximativ 1 µm2/s.50–100 µm/s;valorile sunt similare cu valorile publicate anterior pentru fibrilele amiloide αS sonicate și αS monomerice separat, în condiții de soluție similare44.Când am analizat agregatele cu analiza exploziei TCCD (Fig. 7c, panoul de sus), am constatat că în fiecare agregat izolat (heteroagregat αS/Tau), aproximativ 60% dintre agregatele detectate conțineau atât αS, cât și tau, aproximativ 30% conțineau doar tau, doar aproximativ 10% αS.Analiza stoichiometrică a heteroagregatelor αS/Tau a arătat că majoritatea heteroagregatelor au fost îmbogățite în tau (stoichiometria sub 0,5, numărul mediu de molecule tau pe agregat este de 4 ori mai mare decât moleculele αS), ceea ce este în concordanță cu munca noastră observată în FLIM in situ experimente..Analiza FRET a arătat că aceste agregate conțineau ambele proteine, deși valorile reale FRET în acest caz nu sunt de mare importanță, deoarece distribuția fluoroforilor în fiecare agregat a fost aleatorie din cauza excesului de proteină nemarcată utilizată în experiment.Interesant este că atunci când am efectuat aceeași analiză folosind varianta Tau cu deficit de agregare amiloid matur de 45,46 (a se vedea Fig. 11a, b suplimentară), am observat că, deși agregarea electrostatică αS a fost aceeași (Fig. 11c, d suplimentară), capacitatea de a forma agregate în coacervat a fost redusă drastic și FLIM a detectat mai multe puncte în experimente in situ și au fost observate curbe slabe de corelație încrucișată pentru probele de agregate izolate.Cu toate acestea, pentru un număr mic de agregate detectate (doar o zecime din Tau441), am observat că fiecare agregat a fost îmbogățit în αS decât această variantă Tau, aproximativ 50% dintre agregatele detectate conținând doar molecule αS, iar αS era eterogen în exces. .agregate (a se vedea Fig. 11e suplimentară), spre deosebire de agregatele eterogene generate de Tau441 (Fig. 6f).Rezultatele acestor experimente au arătat că, deși αS în sine este capabil să se acumuleze cu tau în coacervat, nuclearea tau este mai favorabilă în aceste condiții, iar agregatele de tip amiloid rezultate sunt capabile să acționeze ca o formă de αS și tau.Cu toate acestea, odată ce se formează un nucleu bogat în tau, interacțiunile heterotipice dintre αS și tau sunt favorizate în agregate față de interacțiunile homotipice dintre moleculele tau;observăm, de asemenea, rețele de proteine ​​în coacervatele lichide αS/tau.
a Urme temporale de fluorescență reprezentative ale moleculelor individuale ale agregatelor izolate formate în coacervate electrostatice αS/Tau441.Au fost observate explozii corespunzătoare coagregatelor αS/Tau441 (explozi peste pragul indicat) în trei canale de detecție (emisia AF488 și Atto647N după excitație directă, linii albastre și roșii, emisie Atto647N după excitarea indirectă), FRET, linie violetă).b Analiza FCS/FCCS a unui eșantion de agregate izolate αS/Tau441 obținute din LLPS (panoul din stânga).Curbele de autocorelare (AC) pentru AF488 și Atto647N sunt afișate în albastru și, respectiv, roșu, iar curbele de corelație încrucișată (CC) asociate cu agregate care conțin ambii coloranți sunt afișate în violet.Curbele AC reflectă prezența speciilor de proteine ​​monomerice și agregate marcate, în timp ce curbele CC arată doar difuzia agregatelor dublu marcate.Aceeași analiză, dar în aceleași condiții de soluție ca și în petele izolate, probele care conțin numai αS monomeric și Tau441 sunt afișate ca controale în panoul din dreapta.c Analiza flash prin fluorescență a moleculelor individuale de agregate izolate formate în coacervate electrostatice αS/Tau441.Informațiile pentru fiecare agregat găsit în patru repetări diferite (N = 152) sunt reprezentate grafic în raport cu stoichiometria lor, valorile S și eficiența FRET (panoul superior, bara de culoare reflectă apariția).Pot fi distinse trei tipuri de agregate: -agregate numai αS cu S~1 și FRET~0, agregate numai Tau cu S~0 și FRET~1 și agregate eterogene Tau/αS cu intermediare S și FRET Estimări ale cantității dintre ambele proteine ​​marker detectate în fiecare agregat eterogen (N = 100) sunt afișate în panoul inferior (scala de culori reflectă apariția).Datele brute sunt furnizate sub formă de fișiere de date brute.
Maturarea sau îmbătrânirea condensatelor de proteine ​​lichide în structuri asemănătoare gelului sau solide de-a lungul timpului s-a raportat că este implicată în mai multe funcții fiziologice ale condensatului47, precum și în boli, ca proces anormal care precede agregarea amiloidului 7, 48, 49. Aici studiem în detaliu separarea fazelor și comportamentul.LSPT αS în prezența policationilor aleatorii într-un mediu controlat la concentrații micromolare scăzute și condiții relevante din punct de vedere fiziologic (rețineți că concentrația fiziologică calculată a αS este > 1 µM50), în urma comportamentului tipic termodinamic al LPS.Am descoperit că αS, care conține o regiune C-terminală foarte încărcată negativ la pH fiziologic, este capabil să formeze picături bogate în proteine ​​în soluție apoasă prin LLPS în prezența peptidelor dezordonate foarte cationice, cum ar fi pLK sau Tau, prin procesul electrostatic. condensare complexă în prezenţa macromoleculelor de agregare.Acest proces poate avea efecte relevante în mediul celular în care αS întâlnește diverse molecule policationice asociate cu agregarea asociată bolii atât in vitro, cât și in vivo51,52,53,54.
În multe studii, dinamica proteinelor din picături a fost considerată unul dintre factorii cheie care determină procesul de maturare55,56.În coacervarea electrostatică αS cu policationi, procesul de maturare depinde aparent de puterea interacțiunilor cu policationi, de valență și de multiplicitatea acestor interacțiuni.Teoria echilibrului sugerează că un peisaj de echilibru a două stări lichide ar fi prezența unei picături mari bogate în biopolimeri care conduc LLPS57,58.Creșterea picăturilor poate fi realizată prin maturarea Ostwald59, coalescență60 sau prin consumul de monomer liber în faza dispersată61.Pentru αS și Tau441, ΔNt-Tau sau pLK, cea mai mare parte a proteinei a fost concentrată în condensat în condițiile utilizate în acest studiu.Cu toate acestea, în timp ce picăturile de tau de dimensiune completă s-au unit rapid la umezirea suprafeței, coalescența și umezirea picăturilor au fost dificile pentru ΔNt-Tau și pLK, sugerând o pierdere rapidă a proprietăților lichidului în aceste două sisteme.Conform analizei noastre FLIM-FRET, picăturile de pLK și ΔNt-Tau îmbătrânite au prezentat un grad similar de agregare a proteinelor (durată de viață a fluorescenței similare) ca picăturile originale, sugerând că rețeaua proteică originală a fost păstrată, deși mai rigidă.
Raționalizăm rezultatele noastre experimentale în următorul model (Figura 8).Picăturile formate inițial temporar sunt adesea rețele de proteine ​​fără compensare electrostatică și, astfel, există zone de dezechilibru de sarcină, în special la interfața picăturilor, rezultând picături cu un potențial electrostatic ridicat de suprafață.Pentru a compensa sarcina (un fenomen denumit în mod obișnuit epuizarea valenței) și pentru a minimiza potențialul de suprafață al picăturilor, picăturile pot include noi polipeptide din faza diluată, pot reorganiza rețelele de proteine ​​pentru a optimiza interacțiunile sarcină-sarcină și pot interacționa cu alte picături.cu suprafete (umezire).Picăturile de αS/pLK, datorită rețelei lor proteice mai simple (doar interacțiunile heterotipice dintre αS și pLK) și a unei afinități mai mari pentru interacțiunile proteină-proteină, par să poată echilibra mai rapid sarcina condensatului;într-adevăr, am observat o cinetică proteică mai rapidă în coacervatele αS/pLK formate inițial decât în ​​αS/Tau.După epuizarea valenței, interacțiunile devin mai puțin efemere, iar picăturile își pierd proprietățile lichide și se transformă în picături asemănătoare gelului, neinflamabile, cu un potențial electrostatic scăzut de suprafață (și, prin urmare, incapabile să umezească suprafața).În schimb, picăturile αS/Tau sunt mai puțin eficiente la optimizarea echilibrului de sarcină a picăturilor din cauza rețelelor de proteine ​​mai complexe (cu interacțiuni atât homotipice, cât și heterotipice) și naturii mai slabe a interacțiunilor proteinelor.Acest lucru are ca rezultat picături care păstrează comportamentul lichidului pentru perioade lungi de timp și prezintă un potențial electrostatic ridicat de suprafață, care tinde să fie minimizat prin coalescerea și creșterea (minimizând astfel raportul suprafață/volum al picăturilor) și prin umezirea chimiei de suprafață hidrofilă.Acest lucru creează biblioteci mari de proteine ​​concentrate care păstrează proprietățile fluidului, deoarece interacțiunile rămân foarte tranzitorii datorită căutării constante a optimizării încărcăturii în rețeaua de proteine.Interesant, formele trunchiate la N-terminal ale Tau, inclusiv unele izoforme naturale62, prezintă un comportament intermediar, unele coacervate îmbătrânind cu αS în picături asemănătoare gelului cu viață lungă, în timp ce altele se transformă în condensate lichide mari.Această dualitate în maturarea coacervaților electrostatici αS este în concordanță cu studiile teoretice și experimentale recente ale LLPS care au identificat o corelație între epuizarea valenței și cernerea electrostatică în condens ca o cheie pentru controlul dimensiunii condensatului și proprietăților fluidului.Mecanism 58.61.
Această schemă arată calea presupusă de agregare a amiloidului pentru αS și Tau441 prin LLPS și LSPT.Cu regiuni suplimentare bogate în anioni (roșu) și bogate în cationi (albastru), coacervatele electrostatice αS și tau cu valență satisfăcătoare au o energie de suprafață mai mică și, prin urmare, o coalescență mai mică, ceea ce duce la îmbătrânirea rapidă a picăturilor.Se obține o stare stabilă de gel neaglomerat..Această situație este foarte favorabilă în cazul sistemului αS/pLK datorită afinității sale mai mari și a rețelei de interacțiune proteină-pereche mai simplă, care permite o tranziție rapidă asemănătoare gelului.Dimpotrivă, picăturile cu valență nesatisfăcătoare și, prin urmare, regiuni încărcate cu proteine ​​disponibile pentru interacțiune, facilitează coacervatul să fuzioneze și să umezească suprafața hidrofilă pentru a-și reduce energia de suprafață ridicată.Această situație este de preferat pentru coacervatele αS/Tau441, care au o rețea complexă multivalentă constând din interacțiuni slabe Tau-Tau și αS-Tau.La rândul lor, coacervatele mai mari își vor păstra mai ușor proprietățile asemănătoare fluidelor, permițând să apară alte interacțiuni proteină-proteină.În cele din urmă, în fluidul coacervat se formează agregate eterogene amiloide care conțin atât αS, cât și tau, care pot fi legate de cele găsite în corpurile de incluziune, care sunt semne distinctive ale bolilor neurodegenerative.
Structurile mari asemănătoare fluidelor formate în timpul maturării αS/Tau441 cu un mediu proteic foarte congestionat, dar dinamic și, într-o măsură mai mică, coacervatele αS/ΔNt-Tau sunt rezervoare ideale pentru nuclearea agregării proteinelor.Într-adevăr, am observat formarea agregatelor de proteine ​​solide în acest tip de coacervate de proteine, conținând adesea atât αS, cât și tau.Am arătat că aceste heteroagregate sunt stabilizate prin interacțiuni non-electrostatice, sunt capabile să lege coloranții ThT specifici pentru amiloid în același mod ca fibrilele amiloide tipice și, într-adevăr, au rezistență similară la diferite influențe.S-a demonstrat că agregatele αS/tau formate de LLPS au proprietăți asemănătoare amiloidului.Într-adevăr, varianta matură a Tau deficitară în agregarea amiloidului este afectată semnificativ în formarea acestor agregate αS eterogene în coacervatul electrostatic lichid.Formarea agregatelor αS/Tau441 a fost observată numai în interiorul coacervaților, care au păstrat proprietăți asemănătoare lichidului, și niciodată, dacă coacervatele/picăturile nu au atins starea de gel.În acest din urmă caz, puterea crescută a interacțiunilor electrostatice și, ca urmare, rigiditatea rețelei proteice împiedică rearanjamentele conformaționale necesare ale proteinelor pentru a stabili noi interacțiuni proteice necesare nucleării amiloidului.Cu toate acestea, acest lucru poate fi realizat în coacervate mai flexibile, asemănătoare lichidelor, care, la rândul lor, sunt mai probabil să rămână lichide pe măsură ce cresc în dimensiune.
Faptul că formarea agregatelor în cadrul fazei condensate este de preferat în condensatele mari αS/Tau decât în ​​picăturile mici care se gelifică rapid, evidențiază relevanța identificării factorilor care controlează coalescența picăturilor.Astfel, nu numai că există o tendință de separare a fazelor, dar și dimensiunea condensului trebuie controlată pentru funcționarea corectă, precum și prevenirea bolilor58,61.Rezultatele noastre subliniază, de asemenea, importanța echilibrului dintre LLPS și LSPT pentru sistemul αS/Tau.În timp ce formarea picăturilor poate proteja împotriva agregării amiloidului prin reducerea cantității de monomeri proteici disponibili în condiții de saturație, așa cum a fost propus în alte sisteme63,64, fuziunea picăturilor la niveluri ridicate de picături poate duce la agregarea internă a proteinelor prin rearanjamente conformaționale lente.rețele de proteine..
În general, datele noastre subliniază cu tărie relevanța valenței coezive și a interacțiunilor satisfăcute/nesatisfăcute în rețelele de picături în contextul LSPT.În special, arătăm că condensatele αS/Tau441 de lungime completă sunt capabile să fuzioneze și să se nucleeze eficient pentru a forma heteroagregate asemănătoare amiloidului care includ ambele proteine ​​și propun un mecanism molecular bazat pe rezultatele noastre experimentale.Co-agregarea a două proteine ​​în coacervatul fluidului αS/Tau pe care îl raportăm aici poate fi într-adevăr legată de co-localizarea a două proteine ​​în incluziuni, care sunt semne distinctive ale bolii și poate contribui la înțelegerea relației dintre LLPS și agregarea amiloidului, deschizând calea pentru IDP foarte încărcat în neurodegenerare.
WT-αS monomerici, mutanții de cisteină (Q24C-αS, N122C-αS) și variantele ΔCt-αS (Δ101-140) au fost exprimați în E. coli și purificați așa cum s-a descris anterior.5 mM DTT a fost inclus în toate etapele de purificare a mutanților de cisteină αS pentru a preveni formarea legăturii disulfurice.Izoforma Tau441 (plasmidă obținută din Addgene #16316), varianta ΔNt-Tau (Δ1–150, obținută prin donarea IVA cu primeri CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) și varianta AggDef-Tau – primeri purificați cu cultura G31TC coli (ΔGCCACACCGCGG) (ΔΔGC) 7 (G31125). crescut la OD600 = 0,6–0,7 la 37°C și 180 rpm și expresia a fost indusă cu IPTG timp de 3 ore la 37°C.Se recoltează celule la 11.500 xg timp de 15 minute la 4 °C și se spală cu tampon salin care conține 150 mM NaCl.Resuspendați peletul în tampon de liză (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCI 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidină 50 μM, copeptină μM100).Etapa de sonicare a fost efectuată pe gheață cu o amplitudine de 80% pentru 10 impulsuri (1 min pornit, 1 min off).Nu depășiți 60 ml într-o singură ecografie.Lizatele de E. coli au fost încălzite la 95°C timp de 20 minute, apoi răcite pe gheaţă şi centrifugate la 127.000 xg timp de 40 de minute.Supernatantul clarificat a fost aplicat pe o membrană de 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) și dializat împotriva a 4 L de tampon de dializă (20 mM MES, pH 6,8, NaCI 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) timp de 10 ore.O coloană de schimb de cationi de 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, SUA) a fost echilibrată cu tampon de echilibrare (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau-lizatul a fost filtrat printr-un filtru PVDF de 0,22 μm și injectat în coloană la un debit de 1 ml/min.Eluarea a fost efectuată treptat, tau a fost eluat cu tampon de eluție 15-30% (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCI, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fracțiile au fost analizate prin SDS-PAGE și orice fracțiuni care conțineau o bandă cu greutatea moleculară așteptată de tau au fost concentrate folosind un filtru de centrifugă de 10 kDa și înlocuite cu un tampon care conține 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM și DTT 2 mM pentru concentrația finală de proteine ​​a fost de 100 μM.Soluția de proteină a fost apoi trecută printr-un filtru PVDF de 0,22 μm, congelată rapid și depozitată la -80°C.Proteina K18 a fost oferită cu amabilitate de prof. Alberto Boffi.Puritatea preparatului a fost > 95%, așa cum a fost confirmat de SDS-PAGE și MALDI-TOF/TOF.Diverse cisteine ​​au fost marcate chimic cu AlexaFluor488-maleimidă (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA) sau TEMPOL-maleimidă (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).au fost confirmate prin absorbanță și MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau și K18 au fost etichetate cu reziduuri native de cisteină la pozițiile 191 și 322 folosind Atto647N-maleimidă (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germania) urmând aceeași procedură.Hărțile de taxă netă pe reziduu pentru αS și Tau441 au fost generate folosind CIDER66.
Poli-L-lizină solidă (pLK DP 90-110 conform RMN de la furnizor, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, SUA) a fost dizolvată în HEPES 10 mM, NaCI 100 mM, concentrație pH 7,4 până la 10 mM, proces sonicat timp de 5 minute într-o baie de apă cu ultrasunete și păstrați la -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, SUA) și FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, SUA) sunt solubile în apă și sunt distribuite pe scară largă în tamponul LLPS.Dializa elimină sărurile contaminante.Au fost apoi filtrate printr-un filtru de seringă cu o dimensiune a porilor de 0,22 μm, iar concentrațiile lor au fost calculate folosind un refractometru (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, SUA).Probele de LLPS au fost preparate la temperatura camerei în următoarea ordine: tamponul și extrudarea au fost amestecate și 1 mM tris(2-carboxietil)fosfină (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane-). acid 1, 2-diildinitril) tetraacetic (EDTA, carboxinth) și un amestec de 1% inhibitor de protează (PMSF 100 mM, benzimidă 1 mM, leupeptină 5 μM).Apoi se adaugă αS și policationii fuzionați (opțiunile pLK sau Tau).Pentru experimentele în serii de timp cu tioflavină-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), utilizați concentrația totală de ThT să fie jumătate din concentrația αS.Amestecați ușor, dar bine, probele pentru a vă asigura că sunt omogene.Concentrația fiecărei componente a variat de la experiment la experiment, așa cum este descris în secțiunea Rezultate.Azida a fost utilizată la o concentrație de 0,02% (g/v) ori de câte ori durata experimentului a depășit 4 ore.Pentru toate analizele care utilizează probe LLPS, lăsați amestecul să se echilibreze timp de 5 minute înainte de analiză.Pentru analiza împrăștierii luminii, 150 µl de probe au fost încărcate pe microplăci cu 96 de godeuri (µClear®, negru, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) și acoperite cu folie adezivă.LLP-urile au fost monitorizate prin măsurarea absorbanței la 350 nm în centrul soluției într-un cititor de plăci CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Germania).Experimentele au fost efectuate în trei exemplare la 25°C, iar erorile au fost calculate ca abatere standard de la medie.Faza diluată a fost cuantificată prin centrifugare a probei și analiza gelului SDS-PAGE, iar fracția αS din fazele diluate și concentrate a fost cuantificată în diferite soluții LLPS.O probă de 100 μl LLPS care conține αS marcat cu AF488 1 μM a fost preparată prin amestecare completă, urmată de centrifugare la 9600 x g timp de 30 de minute, după care precipitatul a fost de obicei vizibil.Cei 50 μl de supernatant au fost utilizați pentru cuantificarea proteinelor folosind gel SDS-PAGE.Gelurile au fost scanate cu filtre AF488 folosind un sistem de imagistică pe gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA) sau colorate cu colorant Coomassie și vizualizate cu filtre adecvate.Benzile rezultate au fost analizate folosind ImageJ versiunea 1.53i (National Institutes of Health, SUA).Experimentele au fost efectuate în dublu exemplar în două experimente diferite cu rezultate similare.
În mod obișnuit, 150 μl de probe au fost aplicate pe microplăci cu 96 de godeuri fără legare și vizualizate la temperatura camerei pe un microscop inversat Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).Pentru experimentele spot, s-au folosit și plăci de angiogeneză µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania) sau microplăci de polistiren cu 96 de godeuri (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Lămpile cu halogen EL6000 sau cu halogenuri metalice de mercur au fost folosite ca surse de iluminare (pentru imagistica BF/DIC și, respectiv, WF).Pentru microscopia WF, a fost folosit un obiectiv cu aer cu mărire de 40x (Leica Microsystems, Germania) pentru a focaliza lumina pe eșantion și a o colecta.Pentru probele etichetate AF488 și ThT, filtrați excitația și emisia cu seturi standard de filtre GFP, filtre trece-bandă de excitare și emisie, respectiv, filtre trece-bandă de 460-500 nm și 512-542 nm și o oglindă dicroică de 495 nm.Pentru probele etichetate cu Atto647N, a fost utilizat un set standard de filtre Cy5 cu filtre trece-bandă de excitație și emisie 628–40 nm și, respectiv, 692–40 nm și o oglindă dicroică de 660 nm.Pentru microscopia BF și DIC, utilizați același obiectiv de colectare a luminii reflectate.Lumina colectată a fost înregistrată pe o cameră CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Germania).Timpul de expunere a fost de 50 ms pentru imagistica microscopică BF și DIC și 20-100 ms pentru imagistica microscopică WF.Pentru comparație, timpul de expunere pentru toate experimentele cu ThT a fost de 100 ms.Au fost efectuate experimente time-lapse pentru a vizualiza coalescența picăturilor, imaginile fiind colectate la fiecare 100 ms timp de câteva minute.ImageJ (NIH, SUA) a fost utilizată pentru analiza imaginii.Experimentele au fost efectuate în trei exemplare, cu rezultate similare.
Pentru experimentele de colocalizare, FRAP și reconstrucție 3D, imaginile au fost achiziționate pe un microscop confocal inversat Zeiss LSM 880 folosind o ediție albastră ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania).Probele de 50 µl au fost aplicate pe plăci Petri µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germania), tratate cu un polimer hidrofil (ibiTreat) și montate într-un obiectiv de imersie în ulei de 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) pe DIC).Imaginile au fost achiziționate folosind linii laser cu argon de 458 nm, 488 nm și 633 nm cu o rezoluție de 0,26 µm/pixel și un timp de expunere de 8 µs/pixel pentru ferestrele de detectare a excitației și emisiilor de 470-600 nm, 493-628 nm, și 638–755 nm au fost utilizate pentru a vizualiza ThT, AF488 și, respectiv, Atto647N.Pentru experimentele FRAP, fotografia în timp a fiecărei probe a fost înregistrată la 1 cadru pe secundă.Experimentele au fost efectuate în trei exemplare la temperatura camerei cu rezultate similare.Toate imaginile au fost analizate folosind software-ul Zen 2 Blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania).Curbele FRAP au fost normalizate, trasate și adaptate la datele de intensitate/timp extrase din imagini folosind Zen 2 folosind OriginPro 9.1.Curbele de recuperare au fost adaptate la un model mono-exponențial pentru a ține cont de difuzia moleculară cu un termen exponențial suplimentar pentru a explica efectul de albire a achiziției.Apoi am calculat D folosind raza nominală de albire și timpul de înjumătățire de recuperare determinat anterior, ca în ecuația lui Kang și colab.5 35 prezentate.
Variantele de cisteină unică ale αS au fost sintetizate cu 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oxil (TEMPOL) la pozițiile 24 (TEMPOL-24-αS) și 122 (TEMPOL-122-αS), respectiv.Etichetarea spin Pentru experimentele EPR, concentrația αS a fost stabilită la 100 μM și concentrația PEG a fost de 15% (g/v).Pentru diferite condiții de agregare, raportul αS:pLK a fost de 1:10, în timp ce rapoartele αS:ΔNt-Tau și αS:Tau441 au fost menținute la 1:1.Pentru experimentele de titrare de legare în absența aglomerației, TEMPOL-122-αS a fost menținut la 50 μM și policationii au fost titrați la concentrații crescânde, pregătind fiecare condiție separat.Măsurătorile CW-EPR au fost efectuate utilizând un spectrometru în bandă X Bruker ELEXSYS E580 echipat cu un rezonator Bruker ER4118 SPT-N1 care funcționează la o frecvență de microunde (SHF) de ~ 9,7 GHz.Temperatura a fost setată la 25°C și controlată cu un criostat cu azot lichid.Spectrele au fost obținute în condiții nesaturate la o putere MW de 4 mW, o amplitudine de modulație de 0,1 mT și o frecvență de modulație de 100 kHz.Intensitățile spectrale au fost normalizate pentru a evita diferențele de concentrații de spin între probe și o posibilă reducere a spinului din cauza concentrațiilor reziduale ale agenților reducători din probele care conțin Tau441 sau ΔNt-Tau (prezente în soluțiile originale de proteine).Valorile date ale lui g au fost obținute ca urmare a modelării spectrale EPR efectuate cu ajutorul software-ului Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementat în Matlab®67.Pentru modelarea datelor au fost utilizate modele izotrope cu una/două componente.După normalizarea tuturor semnalelor, reziduurile au fost calculate scăzând fiecare simulare din spectrul experimental corespunzător.Pentru analiza de titrare a legării, intensitatea relativă a celei de-a treia benzi la a doua bandă a spectrului EPR normalizat (IIII/III) a fost utilizată pentru a monitoriza legarea policationilor la αS.Pentru a estima constanta de disociere (Kd), curba rezultată a fost ajustată la un model aproximativ presupunând n locuri de legare identice și independente.
Experimentele de spectroscopie RMN au fost efectuate folosind un spectrometru RMN Bruker Neo 800 MHz (1H) echipat cu o criosondă și gradient Z.Toate experimentele au fost efectuate utilizând 130–207 µM αS și echivalenții corespunzători αS/ΔNt-Tau și pLK în 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 și au fost efectuate la 15°C.Pentru a monitoriza LPS prin RMN, 10% PEG a fost adăugat la probele pre-amestecate.Graficul perturbației deplasării chimice (Fig. 1b) arată deplasările chimice medii de 1H și 15N.Spectrele αS 2D1H-15N HSQC au fost atribuite pe baza unei atribuiri anterioare (înregistrarea BMRB #25227) și confirmate prin înregistrarea și analiza spectrelor 3D ale HNCA, HNCO și CBCAcoNH.Deplasările chimice 13Cα și 13Cβ au fost calculate în prezența ΔNt-Tau sau pLK pentru a măsura posibilele modificări ale tendințelor structurii secundare în comparație cu deplasările chimice αS în conformația pură a bobinei aleatoare 68 (Figura suplimentară 5c).Ratele R1ρ au fost măsurate prin înregistrarea experimentelor hsqctretf3gpsi (obținute din biblioteca Bruker) cu întârzieri de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 și 800 ms, iar funcțiile exponențiale au fost ajustate la întârzierile de intensitate de vârf la diferite întârzieri. ori pentru a determina R1ρ și incertitudinea sa experimentală.
Experimentele de microscopie cu fluorescență cu rezoluție în timp în două culori au fost efectuate pe un microscop confocal cu fluorescență MT200 cu rezoluție în timp comercial (PicoQuant, Berlin, Germania) cu un dispozitiv de numărare a unui singur foton corelat în timp (TCSPC).Capul diodei laser este utilizat pentru excitația intercalată în impulsuri (PIE), fasciculul trece printr-un ghid de undă cu un singur mod și este reglat la o putere laser de 10 până la 100 nW pentru linii laser de 481 nm și 637 nm măsurate după o oglindă dicroică.Acest lucru asigură o rată optimă de numărare a fotonilor, evitând efectele aliasării fotonilor, albirii foto și saturației.Lamelele sau plăcile de angiogeneză μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania) au fost plasate direct în apă de imersie peste o lentilă Super Apochromat 60x NA 1.2 cu un guler corectiv (Olympus Life Sciences, Waltham, SUA).O oglindă dicroică de 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, SUA) a fost folosită ca separator al fasciculului principal.Radiația nefocalizată este blocată de o gaură cu diametrul de 50 de microni, apoi radiația focalizată este împărțită în 2 căi de detectare printr-un divizor de fascicul 50/50.Filtre de emisie bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, SUA) 520/35 pentru colorant verde (AF488) și 690/70 pentru colorant roșu (Atto647N) au fost utilizate în fața detectorului.Ca detectoare au fost folosite diode de avalanșă cu un singur foton (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia).Atât colectarea datelor, cât și analiza au fost efectuate folosind software-ul SymphoTime64 disponibil comercial (PicoQuant GmbH, Berlin, Germania).
Cincizeci de microlitri de probe LLPS au fost aplicați în godeurile de angiogeneză μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania).Imaginile rezultate sunt focalizate la 20 µm deasupra fundului godeului pentru distanța optimă de lucru pentru picăturile suspendate și la ~1 µm pentru plute și puncte cu o rezoluție axială de cel puțin 0,25 µm/pixel și un timp de întârziere de 400 µs/pixel.Selectați datele aplicând un prag de intensitate bazat pe intensitatea medie a semnalului de fundal (PBG, medie + 2σ) pentru fiecare canal, astfel încât să fie selectate numai picături de proteine ​​lichide, plute sau pete, eliminând orice origine posibilă din faza dispersată.Pentru a analiza durata de viață a fiecărei specii (τ) a fiecărui canal (verde, „g” pentru AF488 și roșu, „r” pentru Atto647N), am selectat regiuni de interes (ROI) care conțin picături, plute sau pete (Figura 1 suplimentară). ).8b) și le-a derivat prin potrivirea dezintegrarii lor pe durata de viață (τD, τR și τP pentru picături, plute sau pete, respectiv, a se vedea Fig. 8c suplimentară) în fiecare canal utilizând o analiză de potrivire a cozii și un model de dezintegrare cu două componente.Media τ din τ .ROI-urile care au produs prea puțini fotoni pentru o potrivire multi-exponențială au fost excluse din analiză.Limita folosită a fost <104 fotoni pentru plute și puncte și 103 pentru picături.Picăturile au un prag mai scăzut deoarece este dificil să se obțină curbe de dezintegrare cu valori de intensitate mai mari, deoarece picăturile din câmpul imaginii sunt de obicei mai mici și mai puțin numeroase.ROI-urile cu număr de fotoni peste limita de acumulare de fotoni (setată la > 500 de numărări/pixel) au fost, de asemenea, eliminate pentru analiză.Potriviți curba de dezintegrare a intensității obținută din regiunea de interes cu o intensitate la 90% din maxim (puțin după intensitatea maximă a dezintegrarii) de la începutul duratei de viață pentru a asigura interferența IRF minimă, menținând în același timp aceeași pentru toate declinul de intensitate. setări Fereastra de timp relativă Au fost analizate 25 până la 50 ROI pentru plute și spoturi și 15-25 ROI pentru picături, imagini selectate din mai mult de 4 replici înregistrate din cel puțin 3 experimente independente.Testele t cu două cozi au fost folosite pentru a evalua diferențele statistice între specii sau între sistemele coacervate.Pentru o analiză pixel cu pixel a duratei de viață (τ), a fost calculată atenuarea totală a duratei de viață pe câmp pentru fiecare canal și a fost efectuată o aproximare a unui model de atenuare exponențială cu 2/3 componente.Atenuarea duratei de viață pentru fiecare pixel a fost apoi ajustată folosind valorile τ calculate anterior, rezultând o imagine de potrivire FLIM pseudocoloră.Intervalul de viață al tail-fit a fost același pentru toate imaginile aceluiași canal și fiecare dezintegrare a produs suficienți fotoni pentru a oferi o potrivire fiabilă.Pentru analiza FRET, pixelii au fost selectați prin aplicarea unui prag de intensitate mai scăzut de 100 de fotoni, care a avut o medie a semnalului de fundal (FBG) de 11 fotoni.Intensitatea fluorescenței fiecărui canal a fost corectată de factori de corecție determinați experimental: 69 diafonia spectrală α a fost 0,004, excitația directă β a fost 0,0305, eficiența de detecție γ a fost 0,517.Eficiența FRET la nivel de pixel este apoi calculată folosind următoarea ecuație:
unde FDD este intensitatea fluorescenței observată în canalul donor (verde), FDA este intensitatea fluorescenței observată în canalul acceptor (roșu) sub excitație indirectă și FAA este intensitatea fluorescenței observată în canalul acceptor (roșu) sub excitare directă ( PLĂCINTĂ).În canal se observă impulsuri de intensitate a fluorescenței).
Se plasează 100 µl de soluții de reacție LLPS care conțin 25 µM monomeric nemarcat Tau441 (cu sau fără 25 µM αS) în tampon LLPS (suplimentat ca mai sus) pe microplăci cu 96 de godeuri fără legare cu folie adezivă și formarea picăturilor a fost verificată prin microscopie WF. echilibrare.în termen de 10 min.După 48 de ore de incubare la temperatura camerei, s-a confirmat prezența plutelor și petelor proteice.Apoi îndepărtați cu grijă lichidul peste plute din godeuri, apoi adăugați 50 L de tampon de disociere (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) și incubați timp de 10 min.Concentrația mare de sare asigură că LLPS nu se va repeta din cauza PEG rezidual, iar posibilele ansambluri de proteine ​​​​formate numai prin interacțiuni electrostatice vor fi dezasamblate.Fundul godeului a fost apoi îndepărtat cu grijă cu un vârf de micropipete și soluția rezultată a fost transferată într-un godeu de observare gol.După incubarea probelor cu 50 μM ThT timp de 1 oră, prezența petelor izolate a fost verificată prin microscopie WF.Se prepară fibrile αS sonicate prin incubarea a 300 µl dintr-o soluție αS 70-µM în PBS cu pH 7,4, azidă de sodiu 0,01% la 37 °C și 200 rpm pe un agitator orbital timp de 7 zile.Soluția a fost apoi centrifugată la 9600 x g timp de 30 de minute, peletul a fost resuspendat în PBS pH 7,4 și sonicat (1 min., ciclu 50%, amplitudine 80% într-un sonicator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, SUA) probe de fibrile. cu o distribuţie dimensională relativ uniformă a fibrilelor mici.
Analiza FCS/FCCS și detectarea coincidenței în două culori (TCCD) au fost efectuate pe același microscop confocal fluorescent MT200 rezolvat în timp (Pico-Quant, Berlin, Germania) utilizat pentru experimentele de microscopie FLIM-FRET folosind modul PIE.Puterea laserului pentru aceste experimente a fost adăugată la 6,0 uW (481 nm) și 6,2 uW (637 nm).Combinația acestor puteri laser a fost aleasă pentru a produce luminozitate similară pentru perechile de fluorofori utilizate, obținând în același timp rate optime de numărare și evitând fotoalbirea și saturația.Atât colectarea datelor, cât și analiza au fost efectuate folosind software-ul SymphoTime64 versiunea 2.3 disponibil comercial (PicoQuant, Berlin, Germania).
Probele de agregate izolate αS/Tau obținute folosind LLPS sunt diluate în tampon de izolare la concentrația monomoleculară corespunzătoare (de obicei, o diluție 1:500, deoarece agregatele sunt deja la concentrații scăzute atunci când sunt izolate din probe de coacervat).Probele au fost aplicate direct pe lamele (Corning, SUA) preacoperite cu o soluție de BSA la o concentrație de 1 mg/mL.
Pentru analiza PIE-smFRET în canalele verde și roșu, a fost aplicat un prag de intensitate mai scăzut de 25 de fotoni pentru a filtra semnalele de intensitate scăzută cauzate de evenimente monomerice (rețineți că monomerii depășesc numărul probelor agregate în comparație cu agregatele izolate).Acest prag a fost calculat ca fiind de cinci ori intensitatea medie a αS monomerică obținută din analiza probelor de monomeri puri pentru a selecta în mod specific agregatele pentru analiză.Circuitul de comandă PIE, împreună cu achiziția de date TSCPC, a permis aplicarea unui filtru de ponderare pe viață care ajută la eliminarea diafoniei de fundal și spectrale.Intensitatea flare selectată utilizând pragurile de mai sus a fost corectată utilizând semnalul mediu de fundal determinat din histogramele de apariție în funcție de intensitatea/bină a probelor numai tampon.Exploziile asociate cu agregate mari ocupă în mod obișnuit mai multe compartimente consecutive în urmărirea timpului (setat la 1 ms).În aceste cazuri, s-a ales un recipient de rezistență maximă.Pentru analiza FRET și stoichiometrică, a fost utilizat factorul gamma γ (0,517) determinat teoretic.Diafonia spectrală și contribuțiile la excitația directă sunt neglijabile (determinate experimental) la puterea laser de excitație utilizată.Eficiența și stoichiometria FRET într-o explozie se calculează după cum urmează.