Componenta chimică a tubului spiralat din oțel inoxidabil 310 10*1mm, domeniile N-terminale ale spidroinei formează hidrogeluri pe bază de fibrile de amiloid și oferă o platformă pentru imobilizarea proteinelor.

Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Utilizați o versiune de browser cu suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).În plus, pentru a asigura suport continuu, arătăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Glisoare care arată trei articole pe diapozitiv.Utilizați butoanele înapoi și următorul pentru a vă deplasa prin diapozitive sau butoanele controlerului de diapozitive de la sfârșit pentru a vă deplasa prin fiecare diapozitiv.

Specificație

Furnizori de tuburi spiralate din oțel inoxidabil 310 10*1mm

Compoziție chimică

Proprietăți mecanice

Proteinele de mătase de păianjen recombinante (proteinele de mătase de păianjen) au multe aplicații potențiale în dezvoltarea de noi biomateriale, dar natura lor multimodală și predispusă la agregare le face dificil de obținut și ușor de utilizat.Aici raportăm că proteinele spidroin miniaturale recombinante și, mai important, domeniul N-terminal (NT) în sine formează rapid hidrogeluri auto-susținute și transparente la 37 ° C.proteinele de fuziune constând din NT și proteina verde fluorescentă sau purin nucleozid fosforilază formează proteine ​​de fuziune complet funcționale.Hidrogeluri.Rezultatele noastre arată că NT recombinante și proteinele de fuziune oferă randamente ridicate de expresie și dotează hidrogelurilor cu proprietăți atractive, cum ar fi transparența, gelificarea fără reticulare și imobilizarea directă a proteinelor active la densitate mare.
Păianjenii au până la șapte seturi diferite de glande de mătase, fiecare producând un anumit tip de mătase.Toate cele șapte specii de mătase sunt compuse din proteine ​​de mătase de păianjen (spidroine) cu o lungime de aproximativ 6000 de reziduuri și conțin o regiune centrală mare de repetare, înconjurată de domenii sferice N- și C-terminale (NT și CT)1,2.Cel mai studiat tip de mătase, ampula primară, este produsă de glanda ampula primară.În această glandă, un monostrat de celule epiteliale sintetizează proteinele spidroină și le secretă în lumenul glandei, unde sunt prezente sub formă solubilă (doping) la concentrații extrem de mari (30–50% g/v)3,4.Organizarea și conformația principalelor proteine ​​spidroin ampulare din glandă a fost dezbătută, dar majoritatea dovezilor experimentale indică prezența unei conformații elicoidale în general și/sau aleatorie și a structurilor micelare sau lamelare5,6,7,8,9,10.În timp ce domeniile repetitive reglează proprietățile mecanice ale fibrelor de mătase, formând nanocristale β-sheet și structuri amorfe11,12,13,14,15, domeniile finale reglează fibrele de mătase ca răspuns la condițiile în schimbare de-a lungul glandei de mătase16,17,18.Prin controlul formării mătăsii, 19. Domeniile terminale sunt conservate evolutiv și funcția lor poate fi comună tuturor proteinelor spidroinei 2,20,21.În timpul trecerii prin glandă, pH-ul spidroinei scade de la aproximativ 7,6 la < 5,716 și crește cu forfecarea și întinderea mediate de mișcarea prin canalul care se îngustează treptat.În soluție, CT este un dimer paralel constitutiv α-helical17, dar ca răspuns la pH scăzut și forțe de forfecare, CT se desfășoară și schimbă straturile β16, 17, posibil declanșând straturi β în regiunile repetitive ale Convert 16. NT sunt monomerice sub condiții care reflectă condițiile în lumenul glandei și mediază solubilitatea spidroinei, dar la pH redus, protonarea unui număr de lanțuri laterale de acid carboxilic duce la dimerizarea NT cu un pKa de aproximativ 6,5, stabilizând astfel NT și fixând spidroina în mari dimensiuni. cantități.rețele16,18.Astfel, NT joacă un rol cheie în formarea filamentului, trecând de la un monomer în acoperire la un dimer în fibră23,24,25.NT rămâne foarte solubil și elicoidal în toate condițiile studiate până în prezent16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ceea ce a inspirat dezvoltarea sa ca o etichetă de îmbunătățire a solubilității pentru producerea de proteine ​​heterologe.
Mini proteina de mătase de păianjen recombinantă, constând dintr-un NT, o regiune scurtă de repetare, un CT și o etichetă His6 (His-NT2RepCT) pentru purificare, este la fel de solubilă în tampon apos ca proteina nativă de mătase de păianjen și imită caracteristicile native importante ale păianjenului de mătase. .acoperire 25.31.His-NT2RepCT poate fi filat în fibre continue folosind o mașină biomimetică în care o acoperire solubilă cu pH 8 este extrudată într-o baie de apă cu pH 525,32,33,34,35.Fermentarea în bioreactor a E. coli care exprimă His-NT2RepCT și post-tratamentul ulterior a dus la un randament > 14 g/L după purificare.Randamentul ridicat, solubilitatea ridicată și răspunsul adecvat al His-NT2RepCT la condițiile acide sunt toate atribuite NT23, 25, 34.
Aici raportăm formarea rapidă de hidrogeluri transparente din proteine ​​spidroin recombinante, inclusiv numai NT, prin incubarea unei soluții de proteine ​​la 37 ° C.Folosind fluorescența tioflavinei T (ThT), spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR), spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (RMN) și microscopia electronică cu transmisie (TEM), am descoperit că proteinele NT și microspider suferă o transformare structurală în foi β și fibrile asemănătoare amiloidului când se formează geluri.În plus, proteinele de fuziune ale NT și proteina verde fluorescentă (GFP) sau purin nucleozid fosforilază (PNP) formează hidrogeluri cu fragmente de fuziune complet funcționale.Expresia cu randament ridicat în gazde heterologe, cuplată cu formarea rapidă a hidrogelurilor în condiții fiziologice, deschide posibilitatea producției rentabile de hidrogeluri cu funcții proiectate.
Spre deosebire de majoritatea proteinelor spidroin recombinante raportate36, His-NT2RepCT este stabil în tampon Tris-HCl la pH 8 și poate fi concentrat până la 500 mg/mL fără precipitare25.Prin urmare, am fost surprinși să aflăm că această proteină formează rapid hidrogeluri optic clare, auto-susținute atunci când este incubată la 37 ° C (Fig. 1b-d).Studii ulterioare au arătat că gelificarea His-NT2RepCT a avut loc pe o gamă largă de concentrații de proteine ​​(10–300 mg/mL) și că această concentrație a fost invers corelată cu timpul de gelificare (Fig. 1c și Fig. 1 suplimentară).Pentru a afla care părți ale His-NT2RepCT mediază formarea hidrogelului, am examinat apoi fiecare domeniu individual și în diferite combinații folosind un test de inversare a balonului (Figura 1a, b).Toate fracțiile testate de spidroin recombinant au format geluri (la o concentrație de proteine ​​de 300 mg/mL) în mai puțin de 1 oră, cu excepția 2Rep precipitată (Fig. 1b).Acest lucru sugerează că NT și CT singure, în combinație sau asociate cu repetări, se pot gelifica la 37°C și că eticheta His6 nu afectează acest proces într-o măsură semnificativă.Având în vedere noțiunea comună că NT este o proteină foarte solubilă și stabilă și că rapoartele anterioare ale hidrogelurilor recombinate de spidroin au atribuit efecte de gelificare modificărilor conformaționale în regiuni repetate și/sau CT, NT în sine ar putea.Descoperirea gelificării a fost neașteptată.Tabelul suplimentar 1) 37, 38, 39. În mod remarcabil, NT a gelificat deja în 10 minute la o concentrație de ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Experimentele de inversare a flacoanelor cu diferite concentrații de NT au arătat că la >50 mg/mL soluția de NT a gelificat mai repede decât His-NT2RepCT la concentrația corespunzătoare (g/v, Figura 1c).
Reprezentare schematică a diferitelor constructe spidroin studiate în această lucrare.b Timpul de gel la 37 °C pentru diferite proteine ​​spidroin recombinante (300 mg/mL) verificat prin inversarea flaconului.Gel CT imediat fără incubare (<300 mg/mL), 2Rep precipită (300 mg/mL, scară de 5 mm).c Timpul de gel al His-NT2RepCT și NT la concentrațiile de proteine ​​indicate la 37°C.d Fotografii ale hidrogelurilor His-NT2RepCT și NT cu păianjenul și, respectiv, litera „NT” imprimate dedesubt (ambele 200 mg/mL, bară de scară 5 mm).
Hidrogelurile formate din diferite proteine ​​spidroin recombinante au culori ușor diferite, iar observarea cu ochiul liber arată grade diferite de transparență (Fig. 1b).Gelurile NT sunt excepțional de clare, în timp ce alte geluri devin opace.Gelurile His-NT2RepCT și NT turnate în tuburi cilindrice ar putea fi îndepărtate din matriță intacte (Fig. 1d).
Pentru a testa dacă învelișurile naturale de mătase de păianjen se gelifică în condițiile care acum provoacă gelificarea proteinelor spidroin recombinante, învelișurile au fost colectate din glanda ampula mare a păianjenului pod suedez (Larinioides sclopetarius).Acoperirile au fost depozitate în tampon Tris-HCl 20 mM la 50 mg/mL (pe baza greutății uscate măsurate), dar nu a fost observată nicio gelificare în timpul incubației de 21 de zile la 37 ° C (Figura suplimentară 2a).
Pentru a cuantifica aceste geluri, măsurătorile reologice pot fi utilizate pentru a studia procesul de gelificare și a determina proprietățile mecanice generale.În special, monitorizarea modulului de stocare (elasticitate) la temperaturi ridicate poate oferi informații despre temperatura de gelificare, precum și proprietățile vâscoelastice ale acoperirii.Experimentele de creștere a temperaturii (folosind 1°C/min la 25-45°C, bazate pe studiile anterioare folosind soluții stoc de mătase naturală)40,41 au arătat că modulele de stocare a soluțiilor His-NT2RepCT și NT au crescut odată cu creșterea temperaturii.a fost crescută (Fig. 2 și Suplimentar Fig. 3).În special, modulul NT a început să crească la o temperatură mai scăzută în comparație cu His-NT2RepCT, în concordanță cu timpul de gel mai rapid observat atunci când NT a fost incubat direct cu His-NT2RepCT la 37 ° C (Figura 1).După o scădere ulterioară a temperaturii, modulul de stocare nu a revenit la valori mai mici și a rămas peste modulul de pierdere (vezi Fig. 3 suplimentară), indicând o gelificare stabilă ireversibilă termic.După gelificare, modulul elastic final a variat între 15 și 330 kPa pentru hidrogelurile His-NT2RepCT la o concentrație de 100-500 mg/mL, iar modulul elastic final pentru hidrogelurile NT (100-500 mg/mL) a variat între 2 și 1400. kPa (Fig. , 2 și date complete ale rampei) vezi Fig. 3 suplimentară).
a Schimbarea temperaturii în timpul măsurătorilor His-NT2RepCT (300 mg/mL) și b NT (300 mg/mL) cu agitare.Săgețile indică tendința temperaturii, iar umbrirea mai ușoară a datelor modulului de stocare descrie testarea la valori mai mici ale cuplului pentru instrument decât cele specificate de producător, ceea ce este cauza creșterii zgomotului.c Acumularea la modulul final de His-NT2RepCT și NT după temperatură ridicată (100, 300 și 500 mg/mL).Toate citirile modulului sunt luate la o frecvență de 0,1 Hz.
Ca o metodă potențială pentru investigarea modificărilor conformaționale asociate cu gelificarea, am înregistrat spectre FTIR ale His-NT2RepCT și NT înainte și după gelificare la 37 ° C (Figura 3a, b).După cum era de așteptat, spectrele soluțiilor His-NT2RepCT și NT au corespuns proteinelor care prezintă structură secundară α-helix/coil aleatoriu, cu o bandă pronunțată la 1645 cm-1.Pentru ambele hidrogeluri, gelificarea a dus la formarea a două brațe în banda I din mijloc la aproximativ 1617 cm-1 și 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), indicând formarea structurilor β-sheet antiparalele.Aceste modificări pot fi observate clar și în spectrele de gelificare a derivatei a doua și a diferențelor respective (Fig. 4b suplimentară).Cele două benzi ale stratului NT β au fost mai pronunțate decât cele ale His-NT2RepCT, indicând faptul că conținutul total de benzi ale stratului β din hidrogelul NT a fost mai mare decât cel al hidrogelului NT2RepCT.
a spectre de absorbție FTIR ale His-NT2RepCT și b NT (ambele 500 mg/mL) înainte (soluție) și după incubare (gel) la 37°C.c Imagini TEM ale gelurilor NT2RepCT de 50 mg/ml resuspendate și d NT.Bară de scară 200 nm.e Diametrele fibrelor hidrogelurilor His-NT2RepCT și NT.n = 100 fibrile măsurate, p < 0,0001.Barele de eroare arată abaterea standard.Centrul barelor de eroare este media.Un test t nepereche (cu două cozi) a fost utilizat pentru analiza statistică.f Fluorescența ThT a diferitelor proteine ​​spidroin recombinante (100 mg/mL) la 37 °C fără agitare.g Experimente de inoculare cu NT (100 mg/mL) din gel NT 100 mg/mL cu 0%, 5%, 10% și 20% semințe.
Analiza gelului folosind microscopia electronică cu transmisie (TEM) a arătat că hidrogelul constă din fibrile asemănătoare amiloidului (Fig. 3c, 3d).Fibrilele formate de NT erau alungite (5-12 nm în diametru) și neramificate, în timp ce fibrilele His-NT2RepCT erau mai scurte în lungime și semnificativ mai late în diametru (7-16 nm) (Fig. 3e).Aceste rezultate ne-au permis să urmărim cinetica fibrozei folosind testul tioflavine T (ThT).Pentru toate proteinele spidroin recombinante, semnalul fluorescent a crescut atunci când probele au fost incubate la 37 ° C (Fig. 3f, Fig. 5a suplimentară).În conformitate cu această descoperire, examinarea microscopică a NT și His-NT2RepCT în condiții de gelificare a evidențiat o creștere uniformă a fluorescenței ThT fără acumularea locală vizibilă de agregate ThT-pozitive (Figura suplimentară 5b, c).Formarea fibrilelor ThT-pozitive nu a fost însoțită de o creștere a turbidității NT și His-NTCT (Figura suplimentară 5d), ceea ce înseamnă că o rețea de fibrile în gel s-ar putea forma fără a compromite claritatea gelului.Semănarea prin adăugarea de cantități mici de fibrile preformate poate accelera semnificativ formarea fibrilelor unor amiloizi42,43,44, dar adăugarea a 5%, 10% sau 20% (g/g) NT la o soluție de hidrocoagulante NT.efect de însămânțare (Fig. 3g).Poate că acest lucru se datorează faptului că fibrilele din hidrogel sunt relativ fixe și nu pot fi folosite ca semințe.
Comportamentul neașteptat al proteinelor spidroin recombinante la temperaturi ridicate a determinat studii suplimentare de rezonanță magnetică nucleară (RMN) pentru a identifica modificările conformaționale asociate cu formarea gelului.Spectrele RMN ale soluțiilor His-NT2RepCT înregistrate de-a lungul timpului la 37°C au arătat că CT era încă parțial pliat, în timp ce semnalele NT și 2Rep au dispărut (Fig. 4a), sugerând că în principal NT și 2Rep au fost cei care au controlat parțial formarea His- NT2RepCT hidrogel.Semnalul CT a fost, de asemenea, atenuat la 20% din intensitatea sa originală, sugerând că CT este, de asemenea, în mare parte fixat și încorporat în structura hidrogelului.Pentru o porțiune mai mică a CT, care este la fel de mobilă ca în proba preincubată și astfel observată prin soluție RMN, spectrele nu au semnale pentru primele 10 reziduuri structurate, posibil din cauza imobilizării dificile a porțiunii atașate a His-NT2Rep.Spectrele RMN ale stării hidrogelurilor -NT2RepCT au evidențiat prezența predominantă a elicei α și a straturilor β și, într-o măsură mai mică, conformația bobinei aleatoare (Fig. 4b).Analiza deplasării chimice a reziduurilor de metionină prezente numai în NT a arătat că acest domeniu a fost transformat într-o structură β-sheet.Spectrele dependente de timp ale NT în soluție au arătat o scădere uniformă a intensității semnalului (Fig. 4c), iar RMN în stare solidă a hidrogelurilor NT a arătat că majoritatea reziduurilor de NT au fost convertite în structuri β-sheet (Fig. 4d).Conformația lui 2Rep nu a putut fi determinată separat din cauza tendinței sale de agregare.Cu toate acestea, spectrele RMN în stare solidă ale hidrogelurilor NTCT și His-NT2RepCT au arătat foarte asemănătoare (Fig. 4b; Fig. 6b suplimentară), sugerând că 2Rep a contribuit puțin la partea structurală a hidrogelului His-NT2RepCT.Pentru hidrogelurile CT, s-au descoperit că există elice α, foi β și structuri secundare elicoidale aleatoare (Figura suplimentară 6d).Acest lucru sugerează că unele părți ale CT rămân elice α, în timp ce altele devin foi β.Astfel, rezultatele spectroscopiei RMN sugerează că NT este important pentru formarea hidrogelului și, de asemenea, se transformă într-o conformație β-sheet la fuziunea cu 2Rep și CT.În concordanță cu aceasta, am descoperit recent că fermoarele spațiale amiloide se formează probabil în toate cele cinci elice ale domeniului NT, iar algoritmul Waltz a prezis o regiune amiloidogenă în elica 1 (Fig. 4e).
Spectre 2D ale soluției 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT înainte (albastru) și 19 ore după incubare (roșu) la 37°C.Picurile încrucișate individuale în spectrul roșu și F24, G136, poliA în spectrul albastru sunt notate prin simboluri de aminoacizi cu o singură literă și numere de reziduuri.Inserturile arată dependența intensității semnalului de timp pentru reziduurile selectate din domeniile NT, 2Rep și CT.b Spectrele de radiofrecvență în stare solidă (RFDR) ale hidrogelurilor His-NT2RepCT.Corelațiile reziduurilor Cα/Cβ observate în spectrele RFDR au fost determinate prin comparație cu deplasările chimice ale peptidelor model și cu valorile derivate din statistici82,83 și structurile secundare ale acestora.SSB – bandă laterală rotativă.c Spectre unidimensionale ale soluției 15N-HSQC 10 mg/mL NT în timpul incubației la 37 °C timp de 36 de ore.Insertul arată intensitatea volumetrică în funcție de timp.d Spectrele RFDR în stare solidă ale hidrogelurilor NT.Sunt indicate corelațiile reziduurilor Cα/Cβ și structurile lor secundare observate în spectrele RFDR.e Pe baza profilului de tendință la fibrilație NT45.79 din baza de date Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Energia Rosetta a ferestrei spațiale de deplasare a fulgerului a hexapeptidei este afișată în kcal/mol.Barele roșii denotă hexapeptide cu o înclinație mare la fibroză (energie Rosetta sub -23 kcal/mol; sub linia punctată).Barele verzi indică fragmente cu energii Rosetta peste prag și, prin urmare, este mai puțin probabil să formeze fermoare sterice.Fragmentele care conţin prolină au fost excluse din analiză (fără coloane).Pătratele indică zonele de amiloidoză prezise de algoritmul Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Secvența resturilor de aminoacizi ale NT este în partea de sus, iar tipurile de reziduuri găsite în structura secundară β (determinate prin spectroscopie RMN în stare solidă) sunt afișate cu roșu.Pozițiile celor cinci elice NT α sunt desemnate ca (H1-H5)28.
La pH <6,5, HT dimerizează, fiind rezistent la denaturarea indusă de căldură sau uree18.Pentru a elucida modul în care dimerizarea și stabilitatea NT afectează gelificarea, soluțiile care conțin 100 mg/ml NT au fost controlate la pH 8, 7 și 6 utilizând testul de inversare a fiolei.Probele NT incubate la pH 8 și 7 s-au gelificat după 30 de minute la 37 ° C, dar gelul cu pH 8 a rămas clar, în timp ce gelul cu pH 7 a arătat un precipitat vizibil (Fig. 5a).În schimb, o soluție care conține HT la pH 6 nu a format un gel și un precipitat mare a putut fi văzut după 20 de minute la 37°C.Acest lucru sugerează că dimerii înșiși și/sau stabilitatea lor mai mare în comparație cu monomerii împiedică gelificarea.Formarea unui precipitat pentru NT la pH 7 și 6 nu era de așteptat, deoarece s-a raportat că NT este solubil la 200 mg/ml27, se repliază cu ușurință după denaturarea termică și, de asemenea, păstrează un α-helix la valori mai mici de pH 18. O explicație probabilă pentru aceste discrepanțe este că experimentele raportate anterior au fost efectuate la temperatura camerei sau mai jos, sau la concentrații relativ scăzute de proteine16,18,19.
Test de inversare a flaconului NT (100 mg/mL) la pH 8, 7, 6 și 154 mM NaCl (pH 8) după incubare la 37°C.b Spectre NT CD cu și fără 154 mM NaF și, respectiv, 154 mM NaCI.Elipticitatea molară la 222 nm este convertită într-o proporție de pliuri naturale.c Test de inversare NT (100 mg/mL) NT* (37 °C și 60 °C), NTA72R (37 °C) și His-NT-L6 (37 °C și 60 °C).d Spectrele CD ale mutanților NT NT*, NTA72R și His-NT-L6.Elipticitatea molară la 222 nm este convertită într-o proporție de pliuri naturale.e Testul de inversare a NTFlSp, NTMiSp și NTMiSp redus (100 mg/mL).Bara de scara 5 mm.f Spectre CD de NT, NTFlSp, NTMiSp și NTMiSp redus.Elipticitatea molară la 222 nm este convertită într-o proporție de pliuri naturale.Spectrele NT complete la 25 ° C și 95 ° C sunt prezentate în Figura suplimentară 8.
Concentrația fiziologică de sare determină interacțiuni electrostatice între subunitățile NT și dimerizarea transferului NT la pH18 mai scăzut.Am constatat că prezența a 154 mM NaCl și NaF a inhibat într-adevăr gelificarea (Fig. 5a, b; Fig. 2b suplimentară) și că aceste săruri au crescut stabilitatea termică a monomerilor NT (Fig. 5b, Fig. 8 suplimentară) .De asemenea, sugerează că îmbunătățirea stabilității, mai degrabă decât dimerizarea, previne formarea gelului.
Pentru a explora în continuare rolul dimerizării proteinei și al stabilității în gelificare, am folosit doi mutanți, NT* și NTA72R, care rămân, de asemenea, monomerici la pH scăzut de 28,30.NT* este un mutant de inversare a sarcinii duble în care distribuția aparentă a sarcinii dipolare a monomerului este aplatizată, ceea ce previne dimerizarea și crește drastic stabilitatea monomerului.NTA72R este un dipol încărcat, dar Ala substituită cu Arg este situată la limita dimerului, astfel încât mutațiile interferează cu interacțiunile subunităților necesare pentru dimerizare.La incubare la 37 ° C, NT* nu a format un hidrogel, în timp ce NTA72R a format un gel opac timp de 15 minute (Fig. 5c).Deoarece atât NT * cât și NTA72R nu pot dimeriza, dar diferă în stabilitatea monomerului (Fig. 5d), aceste rezultate sugerează cu tărie că stabilitatea termodinamică ridicată împiedică NT să se gelifice.Acest lucru este susținut și de faptul că HT* formează un gel atunci când este instabil la temperatură ridicată (după 8 min la 60°C; Fig. 5c).S-a arătat anterior că conținutul ridicat de metionină din NT lichefiază plierea sa naturală și că șase substituenți Met la Leu (denumiti aici His-NT-L6) stabilizează puternic monomerul NT46.Pe baza ipotezei că flexibilitatea structurală este necesară pentru formarea gelului NT, am constatat că mutantul stabil His-NT-L6 nu s-a gelificat la 37 ° C (Figura 5c, d).Cu toate acestea, His-NT-L6 a format, de asemenea, un gel la incubare la 60°С timp de 60 de minute (Fig. 5c).
Capacitatea NT de a se transforma în structuri β-sheet și de a forma hidrogeluri pare să se aplice unora, dar nu tuturor, domeniilor NT ale spidroinei.NT din diferite tipuri de mătase și specii de păianjen, Trichonephila clavipes (NTFlSp), au format geluri în ciuda conținutului lor relativ scăzut de metionină și a stabilității termice ridicate (Fig. 5e, f și Tabelul suplimentar 2).În schimb, NT din mica proteină ampulară spidroin din Araneus ventricosus (NTMiSp) cu stabilitate termică scăzută și conținut ridicat de metionină nu a format hidrogeluri (Tabelul suplimentar 2 și Fig. 5e, f).Acesta din urmă poate fi asociat cu prezența legăturilor disulfurice intramoleculare29,47.În mod constant, când legăturile disulfurice ale NTMiSp au fost reduse, acesta a format un hidrogel după incubare la 37 ° C timp de 10 minute (Fig. 5e).În concluzie, trebuie remarcat faptul că flexibilitatea structurală este un criteriu important, dar nu singurul, pentru formarea unui gel din NT.Un alt factor care poate fi relevant este tendința de a forma fibrile de amiloid, iar analiza cu baza de date cu fermoar și algoritmul Waltz a arătat o corelație între capacitatea de a forma geluri și prezența regiunilor amiloidogene, precum și amploarea regiunilor prezise. pentru a forma fermoare sterice.A existat o corelație (Tabelul suplimentar 2 și Fig. 9 suplimentară).
Capacitatea NT de a forma fibrile și de a forma geluri în condiții favorabile ne-a determinat să presupunem că fuziunile NT cu alte fragmente de proteine ​​pot încă forma geluri cu funcția deplină a partenerilor de fuziune.Pentru a testa acest lucru, am introdus proteina fluorescentă verde (GFP) și, respectiv, fosforilază nucleozidă purină (PNP) la capătul C-terminal al NT.Proteinele de fuziune rezultate au fost exprimate în E. coli cu randamente finale foarte mari (150 mg/L și 256 mg/L culturi în balon agitat pentru His-NT-GFP și respectiv His-NT-PNP), în concordanță cu ceea ce s-a arătat pentru Alte proteine ​​fuzionate cu NT Ref.30. Proteinele de fuziune His-NT-GFP (300mg/mL) și His-NT-PNP (100mg/mL) au format geluri după 2 ore și 6,5 ore la 37°C și, important, fracțiunea GFP a rămas neschimbată.observat după gelificare, cu > 70% din intensitatea fluorescenței inițiale rămase după gelificare (Fig. 6a).Pentru a măsura activitatea PNP în soluțiile și gelurile his-NT-PNP, a trebuit să diluăm proteina de fuziune cu NT, deoarece activitatea enzimatică a preparatului pur a fost în afara intervalului de detecție a testului la concentrații de gelificare.Gelul format cu un amestec care conține 0,01 mg/mL His-NT-PNP și 100 mg/mL NT a reținut 65% din activitatea enzimatică inițială a probelor preincubate (Fig. 6b).Gelul a rămas intact în timpul măsurării (Fig. 10 suplimentară).
a Intensitate relativă a fluorescenței înainte și după gelificarea His-NT-GFP (300 mg/mL) și a fiolei inversate care conține hidrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) sub lumină vizibilă și UV.Punctele arată măsurători individuale (n = 3), barele de eroare arată abaterea standard.Valoarea medie este afișată în centrul barelor de eroare.b Activitatea PNP a fost obținută prin analiză fluorimetrică folosind soluții și geluri constând din NT (100 mg/ml) și un amestec care conține 0,01 mg/ml his-NT-PNP și 100 mg/ml dolari noi taiwanezi.Insertul prezintă o fiolă inversată care conține un hidrogel care conține His-NT-PNP (bară de scară de 5 mm).
Aici, raportăm formarea de hidrogeluri din NT și alte proteine ​​recombinate spidroin prin incubarea unei soluții de proteine ​​la 37 ° C (Figura 1).Arătăm că gelificarea este asociată cu transformarea elicelor α în straturi β și formarea de fibrile asemănătoare amiloidului (Fig. 3 și 4).Această descoperire este surprinzătoare, deoarece NT-urile sunt mănunchiuri globulare cu cinci helix, cunoscute pentru solubilitatea lor extrem de ridicată și stabilitatea ridicată la concentrații >200 mg/mL la 4°C timp de câteva zile27.În plus, NT-urile se repliază cu ușurință după denaturarea termică la concentrații scăzute de proteine ​​în uM.Conform rezultatelor noastre, formarea fibrilelor necesită o combinație de concentrație de proteine ​​> 10 mg/mL și temperatură ușor ridicată (Fig. 1).Acest lucru este în concordanță cu ideea că fibrilele de amiloid se pot forma din proteine ​​pliate globular care sunt într-o stare parțial desfășurată din cauza fluctuațiilor termice în condiții fiziologice 48 .Exemple de proteine ​​care suferă această conversie includ insulina49,50, β2-microglobulina, transtiretina și lizozima51,52,53.Deși NT este un α-helix în starea sa nativă, aproximativ 65% din lanțul polipeptidic este compatibil cu formarea fermoarului steric (Fig. 4e) 45 .Deoarece monomerul este mobil dinamic46, poate expune aceste regiuni amiloidogene potențiale la temperaturi moderat ridicate și la concentrații mari de proteină totală poate ajunge la o concentrație critică pentru formarea fibrilei de amiloid54.În urma acestui raționament, am găsit o corelație negativă între concentrația spidroinei și timpul de gelificare (Fig. 1c), iar dacă conformația monomerică NT este stabilizată fie prin mutații (NT*, His-NT-L6), fie prin adăugarea de sare, poate preveni formarea hidrogelurilor (Fig. 5).
În cele mai multe cazuri, fibrilele de amiloid dispar din soluție sub formă de precipitat, dar în anumite condiții pot forma hidrogeluri55,56,57.Fibrilele care formează hidrogel au de obicei un raport de aspect ridicat și formează rețele tridimensionale stabile prin încurcarea moleculară,55,58 în concordanță cu rezultatele noastre.Pentru formarea hidrogelului in vitro, proteinele sunt adesea desfășurate complet sau parțial, de exemplu, prin expunerea la solvenți organici, temperatură ridicată (70–90°C) și/sau pH scăzut (1,5–3,0)59,60,61,62.Hidrogelurile cu spidroin descrise aici nu necesită procesare dură și nici nu necesită agenți de reticulare pentru a stabiliza hidrogelurile.
S-a raportat anterior că spidroina se repetă și QD-urile, care par să sufere schimbarea foii β în timpul filării mătăsii, formează hidrogeluri.În comparație cu constatările noastre, timpii de incubare și/sau temperaturile de incubare au fost semnificativ mai lungi sau, respectiv, mai mari, iar hidrogelurile rezultate au fost adesea opace (Figura 7 și Tabelul suplimentar 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. În plus față de timpii de gel rapid, hidrogelurile NT >300 mg/mL (30%) au depășit toate celelalte hidrogeluri recombinate descrise cu proteine ​​de mătase de păianjen, precum și hidrogelurile naturale, cum ar fi gelatina, alginatul (2%), agar (0,5%). ) și colagen.(0,6%) (Figura 7 și Tabelele suplimentare 1 și 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Timpul de gel și modulul elastic al hidrogelurilor din acest studiu au fost comparate cu alte hidrogeluri pe bază de spidroină și hidrogeluri naturale selectate.Referințele sunt date împreună cu o descriere a condițiilor de gelificare.APS Persulfat de amoniu, temperatura camerei.Datele 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Păianjenii par să fi dezvoltat modalități de a preveni gelificarea spidroinei în timpul depozitării.În ciuda concentrației mari de proteine ​​în glanda de mătase, regiunea mare de repetare asociată domeniului terminal înseamnă că concentrația aparentă de NT și CT în glandă corespunde la aproximativ 10-20 mg/ml, la limita acestui studiu.necesare pentru formarea hidrogelului observată in vitro.În plus, concentrații similare de săruri 16 au stabilizat NT, ca în glandele de mătase (Fig. 5b).Conformația NT a fost studiată în citosolul de E. coli și sa dovedit a fi pliată mai strâns decât atunci când a fost examinată in vitro, indicând în continuare că sarea sau alți factori împiedică agregarea acesteia in vivo.Cu toate acestea, capacitatea NT-urilor de a se transforma în fibrile β-sheet poate fi importantă pentru formarea filamentului și ar trebui investigată în studiile viitoare.
Pe lângă aspectele noi ale formării fibrilelor și hidrogelului de tip NT-amiloid observate în acest studiu, arătăm, de asemenea, că acest fenomen poate avea aplicații biotehnologice și biomedicale (Fig. 8).Ca dovadă a conceptului, am combinat NT cu GFP sau PNP și am arătat că proteina de fuziune formează și hidrogeluri atunci când este incubată la 37 ° C și că fracțiile GFP și PNP își păstrează în mare parte activitatea după gelificare (Figura 6).Nucleozide fosforilaze sunt catalizatori importanți pentru sinteza analogilor nucleozidici75, ceea ce face descoperirea noastră relevantă pentru industria biofarmaceutică.Conceptul de exprimare a proteinelor de fuziune care formează hidrogeluri transparente în condiții favorabile permite crearea de hidrogeluri funcționalizate cu proprietăți favorabile pentru o gamă largă de aplicații, cum ar fi imobilizarea enzimelor, eliberarea controlată a medicamentelor și ingineria tisulară.În plus, NT și NT* sunt markeri de expresie eficienți30, ceea ce înseamnă că NT și variantele sale pot fi utilizate pentru producerea cu randament ridicat de proteine ​​de fuziune solubile și crearea ulterioară a proteinelor țintă imobilizate în hidrogeluri 3D.
NT este solubil, α-helical și stabil la concentrații scăzute (µM) și 37°C.La aceeași temperatură, dar la concentrații crescătoare (>10 mg/ml), NT formează geluri formate din fibrile asemănătoare amiloidului.Proteinele de fuziune NT formează, de asemenea, geluri fibrilare cu fragmente de fuziune complet funcționale, permițând diferitelor proteine ​​să fie imobilizate în hidrogeluri 3D folosind NT.Jos: NT (PDB: 4FBS) și ilustrații ale rețelelor de fibre și structurilor proteinelor asociate (presupuse și nedesenate la scară, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Construcțiile (vezi Tabelul suplimentar 4 pentru o listă completă care include secvențele de aminoacizi) au fost donate în plasmida pT7 și transformate în E. coli BL21 (DE3).E. coli conţinând plasmide modificate au fost inoculate în bulion Luria suplimentat cu kanamicina (70 mg/l) şi crescute peste noapte la 30°C şi 250 rpm.Cultura a fost apoi inoculată 1/100 în mediu LB conţinând kanamicina şi cultivată la 30°C şi 110 rpm până când OD600 a atins 0,8.Pentru studiile RMN, bacteriile au fost crescute în mediu minim M9 care conține 2 g de D-glucoză 13C (Aldrich) și 1 g de clorură de amoniu 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) pentru marcarea proteinelor cu izotopi.Coborâți temperatura la 20 de grade Celsius și induceți expresia proteinei cu izopropiltiogalactopiranozidă 0,15 mM (concentrație finală).După exprimarea proteinei peste noapte, celulele au fost recoltate la 7278 x g, 4°C timp de 20 de minute.Peletele celulare au fost resuspendate în Tris-HCI 20 mM, pH 8, și congelate până la utilizare ulterioară.Celulele dezghețate au fost lizate folosind un disruptor celular (mașini din seria TS, Constant Systems Limited, Anglia) la 30 kPa.Apoi lizatele au fost centrifugate la 25.000 g timp de 30 de minute la 4°C.Pentru NTMiSp, peletul a fost apoi resuspendat în uree 2 M, 20 mM Tris-HCI, pH 8, și supus cu ultrasunete timp de 2 minute (2 s pornit/oprit, 65%), apoi centrifugat din nou la 25.000 xg, 4° C. 30 minute.Supernatantul a fost încărcat pe o coloană Ni-NTA, spălat cu 20 mM Tris-HCI, 2 mM imidazol, pH 8 și, în final, proteina a fost eluată cu 20 mM Tris-HCI, 200 mM imidazol, pH 8. Pentru a genera NT2RepCT și NTCT, digestia cu trombinei introduce locul (ThrCleav) între His și NT.Locurile de clivaj ale trombinei sunt de asemenea prezente în His-NT-ThrCleav-2Rep (produce 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produce NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produce CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produce NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produce NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produce NTF1Sp) și His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produce NTMiSp).Construcţiile au fost digerate cu trombină (1:1000) şi dializate peste noapte la 4°C cu 20 mM Tris-HCI, pH 8, utilizând o membrană de dializă Spectra/Por cu un prag de greutate moleculară de 6-8 kDa.După dializă, soluția este încărcată pe o coloană Ni-NTA și efluentul care conține proteina de interes este colectat.Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate prin măsurarea absorbanței UV la 280 nm folosind coeficientul de extincție al fiecărei proteine, cu excepția NTF1Sp, care a folosit testul Bradford conform protocolului producătorului.Puritatea a fost determinată prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă SDS (4-20%) și colorare cu albastru strălucitor Coomassie.Proteinele au fost concentrate folosind filtre de centrifugă (VivaSpin 20, GE Healthcare) la 4000 xg cu o greutate moleculară de 10 kDa în cicluri de 20 de minute.
Dezghețați soluția de proteine ​​și pipetați cu atenție 150 µl într-un flacon transparent de sept de 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Tuburile au fost acoperite și sigilate cu parafilm pentru a preveni evaporarea.Probele (n = 3) au fost incubate la 37°C sau 60°C și s-au inversat periodic pentru a observa gelificarea.Probele care nu s-au gelificat au fost incubate timp de cel puțin o săptămână.Reduceți legăturile disulfurice NTMiSp cu 10 mM DTT per 10 µM proteină.Pentru a analiza gelificarea straturilor de mătase naturală de păianjen, păianjenul suedez de punte a fost tăiat, cele două glande principale ampulate au fost plasate în 200 μl de tampon Tris-HCl 20 mM pH 8 și tăiate pentru a permite acoperirii să se separe de glande..Conținutul glandelor este dizolvat în tampon, 50 pl pentru determinarea greutății uscate (prin incubarea flacoanelor deschise la 60 °C până la greutate constantă) și 150 pl pentru gelificare la 37 °C.
Geometria/unealta de măsurare este realizată din oțel inoxidabil folosind o placă paralelă cu un diametru superior de 20 mm și un spațiu de 0,5 mm.Se încălzește proba de la 25 °C la 45 °C și înapoi la 25 °C cu o viteză de 1 °C pe minut folosind o placă Peltier de fund din oțel inoxidabil.Măsurătorile vibraționale au fost efectuate la o frecvență de 0,1 Hz și în regiunea vâscoelastică liniară a materialului la o deformare de 5% și 0,5% pentru probe de 100 mg/mL și, respectiv, 300–500 mg/mL.Utilizați o cameră de umiditate personalizată pentru a preveni evaporarea.Datele au fost analizate folosind Prism 9.
Pentru colectarea spectrelor infraroșu (IR) la temperatura camerei de la 800 la 3900 cm–1.Dispozitivul ATR, precum și calea luminii prin spectrometru, sunt purjate cu aer uscat filtrat înainte și în timpul experimentului.Soluțiile (500 mg/mL pentru a minimiza vârfurile de absorbție a apei în spectre) au fost pipetate pe cristale și geluri (500 mg/mL) au fost formate înainte de măsurare și apoi transferate în cristale (n = 3).Au fost înregistrate 1000 de scanări cu o rezoluție de 2 cm-1 și un ciclu de lucru zero de 2. A doua derivată a fost calculată utilizând OPUS (Bruker) utilizând un interval de netezire de nouă puncte.Spectrele au fost normalizate la aceeași regiune de integrare între 1720 și 1580 cm-1 folosind F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.În spectroscopia ATR-IR, adâncimea de penetrare a unui fascicul infraroșu într-o probă depinde de numărul de undă, rezultând o absorbție mai puternică la numere de undă mai mici decât la numere de undă mai mari.Aceste efecte nu au fost corectate pentru spectrele prezentate în Fig.3 deoarece sunt foarte mici (Fig. 4 suplimentară).Spectrele corectate pentru această cifră au fost calculate folosind software-ul Bruker OPUS.
În principiu, o cuantificare cuprinzătoare a conformațiilor proteinei este posibilă după deconvoluția fiabilă a componentelor din vârful amidei I.Cu toate acestea, în practică apar unele obstacole.Zgomotul din spectru poate apărea ca vârfuri (false) în timpul deconvoluției.În plus, vârful datorat îndoirii apei coincide cu poziția vârfului amidei I și poate avea o mărime similară pentru probele care conțin o cantitate mare de apă, cum ar fi gelul apos studiat aici.Prin urmare, nu am încercat să descompunăm complet vârful amidei I, iar observațiile noastre ar trebui luate în considerare doar în sprijinul altor metode, cum ar fi spectroscopia RMN.
Soluțiile de 50 mg/ml NT și His-NT2RepCT au fost gelificate peste noapte la 37°C.Hidrogelul a fost apoi diluat cu 20 mM Tris-HCI (pH 8) la o concentraţie de 12,5 mg/ml, agitat bine şi pipetat pentru a sparge gelul.Apoi, hidrogelul a fost diluat de 10 ori cu 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl de probă au fost aplicați pe o rețea de cupru acoperită cu formvar și excesul de probă a fost îndepărtat cu hârtie absorbantă.Probele au fost spălate de două ori cu 5 pl de apă MilliQ și colorate cu formiat de uranil 1% timp de 5 minute.Îndepărtați pata în exces cu hârtie absorbantă, apoi uscați plasa la aer.Imagistica a fost efectuată pe aceste rețele folosind un FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN care funcționează la 100 kV.Imaginile au fost înregistrate la măriri x 26.500 și x 43.000 folosind o cameră CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germania).Pentru fiecare probă (n = 1), au fost înregistrate 10-15 imagini.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) a fost folosit pentru analiza imaginii și măsurarea diametrelor fibrelor (n = 100, fibre diferite).Prism 9 a fost folosit pentru a efectua teste t nepereche (cu două cozi).Mediile His-NT2RepCT și fibrilele NT au fost 11,43 (SD 2,035) și, respectiv, 7,67 (SD 1,389) nm.Intervalul de încredere (95%) este de la -4,246 la -3,275.grade de libertate = 198, p < 0,0001.
80 ui de probe lichide care conţin 10 uM tioflavină T (ThT) au fost măsuraţi în triplicat (n = 3) în condiţii statice utilizând plăci Corning cu 96 de godeuri cu fund negru cu fund transparent (Corning Glass 3881, SUA).Diferențele de fluorescență au fost înregistrate folosind un filtru de excitație de 440 nm și un filtru de emisie de 480 nm (FLUOStar Galaxy de la BMG Labtech, Offenburg, Germania).Semnalul ThT nu a fost nici saturat, nici stins, deoarece au fost efectuate experimente cu diferite concentrații de ThT fără a modifica intensitatea semnalului.Înregistrați absorbanța la 360 nm pentru măsurarea opacității.Pentru experimentele de însămânțare, s-au format geluri de 100 mg/mL la 37°C, s-au resuspendat și s-au folosit pentru însămânțare la raporturi molare de 5%, 10% și 20%.Datele au fost analizate folosind Prism 9.
Dezghețați stocurile de His-NT2RepCT și NT >100 mg/mL pe gheață și filtrați printr-un filtru de 0,22 µm.Concentrațiile au fost calculate prin măsurarea absorbanței la 280 nm folosind Nanodrop.În godeurile unei plăci neagră de legare cu 96 de godeuri (Corning) cu fundul limpede, probele au fost diluate la 20 mg/ml în 20 mM Tris-HCl pH 8 și amestecate cu 5 μM ThT (concentrație finală), concentrația totală a probei volum 50 μl.Probele au fost fotografiate la fiecare 10 minute la 37 ° C pe un microscop CellObserver (Zeiss) cu canal de lumină transmisă și seturi de filtre de excitare și emisie FITC pentru imagistica ThT.Pentru imagini se folosește un obiectiv 20x/0,4.Zen Blue (Zeiss) și ImageJ (https://imagej.nih.gov/) au fost folosite pentru analiza imaginii.Gelurile au fost, de asemenea, preparate din soluții NT și His-NT2RepCT la o concentrație de 50 mg/mL care conține 20 mM Tris pH 8 și 5 pM ThT și incubate la 37°C timp de 90 min.Bucățile de gel au fost transferate într-un godeu nou care conține 20 mM Tris, pH 8 și 5 μM ThT într-o placă de fund transparentă neagră cu 96 de godeuri.Obțineți imagini cu fluorescență verde și câmp luminos la o mărire de 20x/0,4.ImageJ a fost folosit pentru analiza imaginii.
Spectrele RMN în soluție au fost obținute la 310 K pe un spectrometru Bruker Avance Neo de 600 MHz echipat cu o criosondă de câmp cu gradient în impulsuri cu rezonanță cu patru poli QCI (HFCN).Probe RMN care conțin 10 mg/mL proteină omogenă marcată cu 13C, 15N, dizolvată în 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (g/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Deplasările chimice ale NT2RepCT la pH 6,7 au fost utilizate pentru a atribui vârful 23 în spectrul 2D al 15N-HSQC.
Spectrele RMN solide cu rotire în unghi magic (MAS) ale hidrogelurilor marcate cu 13C, 15N au fost înregistrate pe un spectrometru Bruker Avance III HD la 800 MHz echipat cu o sondă fără electroni 13C/15N{1H} de 3,2 mm.Temperatura eșantionului a fost controlată folosind un flux de gaz cu temperatură variabilă la 277 K. Spectrele de rezonanță bidimensională de rotație a dipolului (DARR)76 și reconectarea de radiofrecvență (RFDR)77 au fost achiziționate la frecvențe MAS de 12,5 kHz și, respectiv, 20 kHz.Polarizarea încrucișată (CP) de la 1H la 13C a fost efectuată folosind o rampă liniară de la 60,0 la 48,0 kHz la 1H, 61,3/71,6 kHz la 13C (la 12,5/20 kHz MAS) și timpul de contact 0,5-1 ms.Decuplarea Spinal6478 la 73,5 kHz a fost utilizată în timpul colectării datelor.Timpul de achiziție a fost de 10 milisecunde, iar întârzierea ciclului a fost de 2,5 secunde.Corelațiile Cα/Cβ cu legături unice observate în spectrele RFDR au fost atribuite pe baza deplasărilor chimice caracteristice de tip reziduu și a corelațiilor cu legături multiple din spectrele DARR.
Baza de date Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) a fost utilizată pentru a evalua tendințele de flutter și energia Rosetta pentru NT, NTFlSp și NTMiSp.Baza de date Zipper calculează Rosetta Energy80, care combină mai multe funcții de energie liberă pentru a modela și analiza structura proteinelor.Un nivel de energie de -23 kcal/mol sau mai mic indică o tendință mare de fibrilare.Energia mai mică înseamnă mai multă stabilitate a celor două fire β din conformația fermoarului.În plus, algoritmul Waltz a fost utilizat pentru a prezice regiunile amiloidogene în NT, NTFlSp și NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Soluția de proteină NT a fost amestecată cu tampon de acid 2-(N-morfolino)etansulfonic (MES) la pH 5,5 și 6,0 pentru a scădea pH-ul la pH 6 și, respectiv, 7.Concentrația finală de proteine ​​a fost de 100 mg/ml.
Măsurătorile au fost efectuate pe un spectrometru J-1500 CD (JASCO, SUA) folosind o cuvă de 300 μL cu o cale optică de 0,1 cm.Proteinele au fost diluate la 10 μM (n = 1) în tampon fosfat 20 mM (pH 8).Pentru a analiza stabilitatea proteinei în prezența sării, proteinele au fost analizate la aceeași concentrație (n = 1) în tampon fosfat 20 mM (pH 8) care conține 154 mM NaF sau, respectiv, NaCI.Scanările de temperatură au fost înregistrate la 222 nm de la 25°C la 95°C cu o viteză de încălzire de 1°C/min.Proporția proteinelor pliate nativ a fost calculată folosind formula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).În plus, au fost înregistrate cinci spectre pentru fiecare probă de la 260 nm la 190 nm la 25°C și după încălzire la 95°C.Cinci spectre au fost mediate, netezite și convertite la elipticitate molară.Datele au fost analizate folosind Prism 9.
Intensitatea fluorescenței His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 uL) a fost măsurată în triplicat (n = 3) în plăci Corning cu 96 de godeuri cu un fund negru transparent (Corning Glass 3881, SUA) în condiții statice.Măsurați probe cu un cititor de plăci pe bază de fluorescență cu o lungime de undă de excitare de 395 nm și înregistrați emisia la 509 nm înainte de gelificare și 2 ore mai târziu la 37°C.Datele au fost analizate cu Prism 9.
Trusa de analiză a activității purin nucleozide fosforilază (metoda fluorometrică, Sigma Aldrich) a fost utilizată conform instrucțiunilor producătorului.Pentru a măsura activitatea în geluri și soluții care conțin His-NT-PNP, amestecați 10 ng de His-NT-PNP cu 100 mg/mL NT la un volum total de 2 µL deoarece gelul a dat un semnal peste intervalul de detectare al setului.Au fost incluse controale pentru geluri și soluții fără His-NT-PNP.Măsurătorile au fost efectuate de două ori (n = 2).După ce activitatea a fost măsurată, amestecul de reacție a fost îndepărtat și gelul a fost fotografiat pentru a se asigura că gelul a rămas intact în timpul măsurării.Datele au fost analizate folosind Prism 9.
Pentru mai multe informații despre proiectarea studiului, consultați rezumatul studiului Nature legat de acest articol.
Figurile 1 și 2 prezintă datele inițiale.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f și 6, Figurile suplimentare.3, fig.5a, d, fig.6 și fig.8. Date Datele din acest studiu sunt găzduite în baza de date Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Datele RMN obținute în acest studiu au fost postate în depozitul BMRBig sub ID-ul de intrare bmrbig36.Structurile GFP și PNP au fost preluate din PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. și Johansson, J. Spinning artificial spider matase.National Chemical.biologie.11, 309–315 (2015).
Babb, PL şi colab.Genomul Nephila clavipes evidențiază diversitatea genelor de mătase de păianjen și expresia lor complexă.National Genette.49, 895–903 (2017).